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1、实验六酵母RNA的提取与含量测定13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-10同组者：张奕一、实验目的1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。2.掌握紫外分光光度计的使用。3.了解和掌握紫外吸收法测定RNA浓度的原理。二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在260nm左右，且一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比（浓度为5g/ml45g/ml吸光度与浓度成正比），利用此性质
2、，可用RNA标准液绘制RNA吸光标准曲线(标准曲线的斜率为0.022-0.024左右)，测定样品RNA浓度。由于蛋白质在280nm的光吸收，对核酸测定有一定的干扰作用，最大吸收峰在280nm处，原因是蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸。所以如果有蛋白质的干扰必须得先测260nm处的吸光度，再测280nm处的吸光度，通过计算消除其对核酸的影响。三、实验器材干酵母粉电子天平量筒容量瓶100ml磁力搅拌器试管100水浴锅pH试纸（pH1-14）烧杯离心机722型分光光度计锥形瓶离心管四、实验试剂0.2%氢氧化钠溶液95%乙醇无水乙醚酸性乙醇（5ml浓Hcl加入到500ml95%乙醇中混匀
3、）RNA标准蛋白溶液（200g/ml）五、实验步骤1.RNA的提取（1）称取4g干酵母粉，放入200ml锥形瓶中，加入40ml0.2%的氢氧化钠 溶液混匀，在沸水浴中煮沸30min中并冷却；（2）冷却后，把液体倒入离心管中，在4000r/min的条件下离心15min；（3） 离心后留上清液加入95%的酸性乙醇40ml，边加边搅拌，静置5min左右，再4000r/min的条件下离心5min；（4）离心后保留沉淀，用20ml 95%乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗后在3000r/min的条件下离心5min；（5）离心后的沉淀再用无水乙醇10ml洗涤两次，每次用3000r/min离心5min；（6）离心结
4、束后，收集沉淀与滤纸上，称重备用。2.RNA样液的配制（1）取粗RNA0.2-0.25g与烧杯中，加入5mlNaOH溶液，搅拌，溶解，调成糊状。（2）再加入蒸馏水40ml，搅拌混匀，调PH至7.0后，放入100ml容量瓶中定容。（3）再分3-4次分别取2ml定容后溶液于100ml容量瓶中继续定容待测,并且把容量瓶依次编号为A、B、C。3.RNA标准曲线的绘制（1）取洁净的试管，依次标号为1-10、A、B、C后，按照下表分别往各试管中加所需液体，并用磁力搅拌器混匀。（2）混匀后以0号试管为参比液，在260nm下测各试管的吸光度A，并根据0-9试管的吸光值绘制出RNA标准曲线，并最终得出样品的浓度
5、。六、注意事项1.离心机的使用，使用前一定要将两离心液（包括外壳）在天平上调平，对称放置在离心机上，防止力臂不对称而损坏离心机。2.紫外分光光度计的使用，要先预热10分钟，往比色皿中到液体只需到三分之二即可，防止液体溢出腐蚀仪器，爱护仪器。 七、实验结果1.RNA样液的配制 称取RNA样品的质量：0.200g2.RNA标准曲线的绘制表一 紫外光测RNA标准溶液配制表编号123(舍弃)45(舍弃)6(舍弃)78910样品（ml）00.51.01.52.02.53.03.54.04.5水（ml）10.09.59.08.58.07.57.06.56.05.5总体积（ml）10.010.010.010
6、.010.010.010.010.010.010.0浓度（g/ml）05.010.015.020.025.030.035.040.045.0A260nm00.0740.1920.2340.4470.4430.4960.5800.6640.743表二 紫外光测样品RNA浓度溶液配制表编号1112131415(保留)1617(保留)1819样品（ml）2.51.00.50.20.20.20.20.20.2水（ml）2.54.04.59.89.89.89.89.89.8总体积（ml）5.05.05.010.010.010.010.010.010.0总稀释倍数200500100050005000500
7、0500050005000A260nm/2.1800.4210.4710.5700.4690.4290.380样品A260nm = 0.470计算得浓度C=1424.24g/ml质量=0.142g质量分数=71.2%八、讨论与结论1提取的RNA干燥后，最终得到是乳白色的块状固体，而纯度较高的RNA干燥后应为白色，根据其颜色可分析出其纯度较低，含有杂质较多，原因为洗涤时未洗干净。2.在测定RNA样液时，一定要避免假重复，不是取二次定容后的样液连测三次，而是取第一次定容后的样液取三次，分别再定容一次，分别测定，这样可以消除定容误差、移取溶液时的误差，如果分别测定的结果相差较大，可以再取第一次定容后的溶液继续定容，取最接近的三组（由于操作误差太大，只选了两组）。3.由回归直线可知，本次实验的数据基本在一条直线上，说明实验结果较准确。
