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1、DNA序列测定,医学分子生物学,DNA序列测定的概念,指DNA链上各脱氧核苷酸的排列顺序的确定。,第一代测序技术：Sanger(1977)双脱氧链末端终止法Maxam和Gilbert(1977)化学降解法,第三代测序（单分子测序）技术：Pacific Biosciences(2011?)SMRT sequencingetcMany,第二代测序（Next-generation sequencing）技术：Roche 454(2005)pyrosequencingIllumina(2007)reversible terminatorABI SOLiD(2007)sequencing-by-liga
2、tion,原理：1.DNA polymerase作用下的引物延伸2.特异性的链终止3.可区别单碱基长度的变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳（PAGE）方法：Sanger双脱氧链末端终止法,第一代测序技术 Sanger法,Sanger，1952，胰岛素一级结构 1977，X174噬菌体一级结构,2,3-ddNTP与普通dNTP不同，在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基；ddNTP在聚合酶作用下掺入到DNA链中，但由于没有3羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。,Sanger双脱氧链末端终止法,在DNA合成反应混合物加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异
3、的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。,制备单链模板DNA模板与引物的结合（退火）DNA链的延伸及终止电泳放射自显影读片,测序的基本步骤,引物：通常情况下，可将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链DNA分子作为模板。在此情况下，可采用能与载体序列相退火的通用引物，而不必取得与未知DNA序列互补的引物。,模板：两类DNA可以用作Sanger法测序的模板：纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA。小量制备的质粒DN
4、A常常被寡脱氧核糖核苷酸小分子、核糖核酸及DNA聚合酶的抑制剂所污染，其中前两种污染物可被用作随机引物，影响结果。,DNA聚合酶：用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶如Klenow酶，测序酶（T7 DNA聚合酶），Taq DNA聚合酶。这些酶的特性差别悬殊，因而可大大影响通过链终止反应所获得的DNA序列的数量的质量。,测序酶：完全缺失3-5外切核酸酶活性，极其稳定，持续合成能力强，聚合速率高，它是测定长段DNA序列的首选酶。测序酶可以沿模板移动很长的距离，测序的长度更多是受聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力而不是受该聚合酶的特性所制约。,Taq DNA聚合酶：适于测定在37形成大段稳定二级结构的单链DN
5、A模板序列。这是因为Taq DNA聚合酶在70-75活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构。这种酶的持续合成能力甚佳。,1987年，美国应用生物系统（ABI）公司推出快速、准确的自动测定DNA顺序的新方法，即激光测序法和配套的自动测序仪。其基本原理仍是基于Sanger法。关键词：荧光染料、毛细管电泳,DNA测序的自动化,较大片段DNA片段测序的策略,鸟枪法（shotgun sequencing）引物步查法（primer walking）,1.鸟枪法,大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体；小片段测序完成后，根据重叠区，计算
6、机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。有三种方法可用来将DNA大片段切割成小片段：限制性内切酶、超声波处理和DNA酶I降解(加Mn2+)。,2.引物步查法,最初的序列数据是通过利用载体上的引物获得的，一旦新的序列被确认，与新获得序列的3端杂交的寡核苷酸就能合成，并能以之为引物进行下一轮的双脱氧测序反应。这样，从两头向中间，序列被一步步测序。,人类基因组测序的策略,人类基因组测序中，存在着两种不同的战略，即全基因组随机测序战略和以物理图为基础的以大片断克隆为单位的定向测序战略。两者的最大区别在于是否依赖基因组作图。,1.全基因组鸟枪法策略,对人类基因组采用随机测序方法，需要7
7、000万个独立序列，每个长500bp，即总长度为人类基因组的10倍左右。再利用计算机软件进行拼装。,2000 年3 月全基因组鸟枪法获得果蝇全基因组序列。,全基因组鸟枪法测序的优缺点,优点：速度快 缺点：随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误,2.克隆重叠群策略,先构建遗传图，再利用几套高度覆盖的大片段基因组文库（BAC、PAC等）获得精细的物理图，选择合适的BAC或PAC克隆测序，利用计算机拼装。相互关联、部分重叠的BAC克隆连成一个大的重叠群（Contig）。,1999 年 12月克隆重叠群法获得人类第22号染色体完整序列,
8、克隆DNA生成一系列荧光标记的仅差别一个碱基的DNA混合物DNA分子的分离检测荧光，读取DNA序列单一DNA序列长度5001000bp每台测序仪每次运行可生成57000 bp序列将序列拼装成基因组,总结 第一代测序的基本流程,第二代测序，也称下一代测序（next-generation sequencing），将片段化的基因组DNA两侧连上接头，并用不同方法产生多个空间固定的PCR克隆阵列。然后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有克隆均位于同一平面，这些反应就能够大规模平行进行，通过检测荧光，可获得测序数据。不断重复序列延伸和成像检测，最后经过计算机分析即可获得完整DNA序列信息。,第二代测序,提
9、取DNA将DNA连接在某种介质上延伸与扩增DNA通过显微镜检测荧光信号，生成一系列短序列单一DNA序列长度约30300bp每次运行生成0.4 4 GB数据作图，或将数据与基因组序列进行比对,第二代测序的基本流程,3 Gb=,第一代与第二代测序成本比较,第一代,第二代,Roche 454 GS FLX:焦磷酸测序(pyrosequencing),乳液PCR(emulsion PCR)Illumina Solexa GA:reversible terminator 以上为基于合成的测序(sequencing by synthesis,SBS)技术Appled Biosystems SOLiD:基于
10、连接的测序(sequencing-by-ligation),乳液PCR,第二代测序的三种技术,Roche 454 Genome Sequencer FLX,454公司于2005年提出该技术，2007年推出优化的GS FLXRoche于2007年并购454公司，以不到100万美元的成本测定Watson的基因组序列2010年将推出初级版的GS Junior，预计每次反应得到10万条序列，适用于小型实验室核心技术：焦磷酸测序 pyrosequencing,454 基因组测序原理,Roche 454 GS FLX 的优缺点,单一反应片段长(up to 400 bp),设计用于从头测序(de novo
11、sequencing)如用于重测序(resequencing)则成本过高因此，454系统最适合用于新基因组的测定Baylor Genome Center involved in Sea Urchin,Bee,Platypus genomes:They have a number of 454.,Illumina Solexa Genome Analyzer,2005年由Solexa公司研发，2007年正式上市采用基于合成的测序(sequencing by synthesis,SBS)原理性价比最高的第二代测序技术核心技术：DNA合成的可逆终止 reversible terminator,Sol
12、exa 基因组测序原理,单次运行可完成5000万通道测序,Illumina Solexa GA 的优缺点,单一反应片段短(30-50 bp),不能用于复杂真核基因组的从头测序 性价比最高，重测序(resequencing)首选与Sanger测序仪(3730,Megabase,etc)或Roche 454 GS FLX联合使用测定复杂基因组,Applied Biosystems SOLiD 3 plus,2005年提出原理，2007年正式推出采用基于连接的测序(sequencing-by-ligation)原理准确度最高(99.999%)的第二代测序技术核心技术：基于连接的测序,SOLiD 测序
13、原理 1.DNA扩增与固定,SOLiD 测序原理 2.Oligo探针,SOLiD 测序原理 3.连接酶循环反应,最终，每个碱基可以得到两次测定,SOLiD 测序原理 4.将荧光信号转换为序列,ABI SOLiD 的优缺点,与Solexa一样，单一反应片段短，只能用于简单基因组的从头测序而不能用于复杂基因组测序准确度最高(15X覆盖率可达99.999%),通量最高(单次运行 4 GB数据)与Sanger测序仪(3730,Megabase,etc)或Roche 454 GS FLX联合使用测定复杂基因组,第二代测序三种技术及Sanger法的对比,第二代测序的应用,从头测序:454或Sanger 加
14、上 Solexa/SOLiD.2009年完成黄瓜基因组,Solexa+Sanger,3.9倍用Sanger法得到,68.3倍用Solexa得到重测序:2008年,千人基因组计划SNP研究:Solexa,低成本高通量,转录组和表达谱分析:对细胞内所有mRNA进行测序,分析mRNA序列数量判断基因表达,分析同一基因的不同转录本以及基因突变小RNA研究:Solexa/SOLiD测定片段30-50 bp正好涵盖小RNA(18-40 nt)范围,已采用Solexa技术发现新的小RNA转录调控研究:通过将ChIP和第二代测序结合,可直接测定与蛋白质结合的DNA序列,第三代测序,Biosciences公司的
15、HeliscopePacific Biosci公司的SMRT sequencing(单分子实时测序)Oxford Nanopore公司的纳米孔单分子测序etc.,Pacific 的 SMRT sequencing,SMRT-seq的三个支撑技术,荧光标记的dNTP。荧光标记的dNTP被掺入DNA链时，荧光能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，荧光基团被DNA聚合酶切除，荧光消失。纳米微孔。直径只有几十nm的孔 zero-mode waveguides(ZMWs)，DNA聚合酶被固定在这个孔内。当特定荧光标记的dNTP被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止。共聚焦显微镜。实时地快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录。,SMRT-seq的优势,速度快。每秒10 bp，等同于DNA聚合酶的合成速度。合成片段长。1000 bp以上。精度高。99.9999%。,
