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1、重组菌转化木犀草素生成3，-0-甲基化木犀草素的研究摘要：通过几种带有甲基转移酶基因的质粒进行重组菌的构建，并通过酶活的测定筛选出表达较好的甲基转移酶并构建重组菌，对筛选出的甲基转移酶进行表达上的条件优化，主要是通过转化天然底物类黄酮木犀草素生成甲基化木犀草素，确定重组菌最优转化效率的条件：以最优的转化条件进行高密度发酵，进一步提高其产量和转化率。关键词：重组菌、甲基化木犀草素、全细胞转化。1材料与方法1.1 重组质粒转化大肠杆菌表达宿主感受态细胞热激转化取1L重组质粒于80LE.coliBL21(DE3)感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置Iomin。将感受态细胞置于42。C水浴中热激2min,
2、然后冰浴5min。加入1mL预热的SOC培养基混合，37。C摇床中震荡培养30min。菌液均匀涂布在含重组质粒所带抗性的LB平板上,在37。C恒温培养箱中倒置培养至长出单菌落。重组质粒PCDFDUet-PFOMT和PACYCDUet-SAMS-S共转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)获得重组菌BL21-PFOMT-SAMS-S。1.2 重组菌转化木犀草素为3253035。C和40。C)转化24h后用于HPLC测定。（3）重组菌转化最适木犀草素底物浓度将冷冻保存的重组菌BL2I-PfOMT-SAMS-S接种到LB试管中（50gmL盐酸大观霉素），37。C过夜活化培养，将已活化的菌种分别接种
3、到10根试管中，设置底物木犀草素的终浓度分别为200mgL,400mg/L、800mgL1.6g/L和2gL,转化温度设定为30久，进而转化木犀草素生产30甲基化木犀草素，转化时间24h后用于HPLC测定。（4）最适DMSo比例将冷冻保存的重组菌BL2I-PfOMT-SAMS-S接种到LB试管中（50gmL盐酸大观霉素），37。C过夜活化培养，将已活化的菌种分别接种到10根试管中，设定DMSo的比例分别为1%、3%、5%、7%和9%,两组平行实验，转化温度设定为3（TC,进而转化木犀草素生产3，-0-甲基化木犀草素，转化时间24h后用于HPLe测定。（5）最适初始生物量OD6oonm将冷冻保存
4、的重组菌BL2I-PfOMT-SAMS-S接种到LB试管中（50gmL盐酸大观霉素），37。C过夜活化培养，将已活化的菌种分别接种到10根试管中，于37。C摇床18OrPm培养，当初始ODeoonm分别为0.6,0.8,1.0,1.4,1.6和2.0的不同生物量阶段中，加入诱导剂IPTG浓度为0.2mM,DMSO比例为3%,0.3g/L的SAM,底物木犀草素终浓度为400mgL,设置转化温度为30。C的条件下转化木犀草素生产30-甲基化木犀草素，转化时间24h后用于HPLC测定。（6）重组菌转化最适诱导时机将冷冻保存的重组菌BL2I-Pfomt-SAMS-S接种到LB试管中（50gmL盐酸大观
5、霉素），37。C过夜活化培养，将已活化的菌种分别接种到10根试管中，之后在诱导时间分别为Oh、3h、6h、9h、12h的不同产酶时间下再添加DMSo为3%,0.3g/L的SAM,底物终浓度800mg/L的条件下转化木犀草素生产3。O-甲基化木犀草素，转化时间24h后用于HPLC测定。（7）重组菌转化最适碳源培养优化将冷冻保存的重组菌BL2I-Pfomt-SAMS-S接种到LB试管中（50gmL盐酸大观霉素），37。C过夜活化培养，将已活化的菌种接种到分别含有1%的甘油、糊精、麦芽糊精、菊粉、葡萄糖不同碳源的TB5mL试管中，37。C摇床18OrPm培养，初始OD600nm为1.4,加入诱导剂I
6、PTG浓度0.2mM,之后于产酶时间3h后添加DMSO比例为3%,0.3g/L的SAM,底物终浓度800mg/L的条件下转化木犀草素生产3，-O-甲基化木犀草素，转化时间24h后用于HPLC测定。1.3 重组菌转化木犀草素生成3。O-甲基化木犀草素的反应时间曲线将冷冻保存的重组菌BL2I-Pfomt-SAMS-S接种到5mL的LB试管中（50gmL盐酸大观霉素），37过夜活化培养，将已活化的菌种接种到含有1%的甘油碳源的25OmLTB培养基中，37C摇床18OrPm培养，初始OD600nm为1.4,加入诱导剂IpTG浓度0.2mM,在诱导3h后添加DMSO比例为3%,0.3g/L的SAM,底物
7、终浓度1g/L的条件下转化木犀草素生产30-甲基化木犀草素，30摇床转化时间分别为12h、24h、36h、48h和60h下进行取样，之后以5倍体积的甲醇加入取样液中终止反应，1200OrPm离心5min取上清液,之后过0.22m有机相滤膜后用于HPLC测定。2结果与分析2.1 重组菌BL21-PFOMT-SAMS-S合成3，-0.甲基化木犀草素的条件优化2.1.1 最适反应温度和诱导剂IPTG浓度3502025303540Temperature()300250200150IOO500图2-15温度对转化的影响不同温度不同诱导剂IPTG培养下，3。0.甲基化木犀草素的产量结果如图2-15所示。图
8、中显示重组菌BL2I-PfOMT-SAMS-S对于木犀草素的转化在转化温度为30。C的条件下效果最佳,其3O-甲基化木犀草素的产量可达到285mg/Lo温度在一定范围内其产物会随着温度升高而产量增大，但如果温度继续升高其产物产量可能会下降，同理也是其酶活随温度变化高低。从图2-16可知，诱导剂IPTG浓度为0.2mM时，3，-0-甲基化木犀草素的产量较高为294mg/L。低浓度的诱导剂有助于3O-甲基化木犀草素生成的甲基转移酶的诱导产生。而当诱导剂浓度达到0.2mM后，重组蛋白的表达可能并不能继续提高，而且过高的诱导剂浓度也不利于重组蛋白的可溶性表达和重组菌的生长，因此需要合适的诱导剂浓度才有
9、利于3，-O-甲基化木犀草素的产生。IlliIl00.10.20.40.60.8IPTG(rnM)图2-16IPTG浓度对转化的影响2.1.2 最适DMSo浓度对转化的影响重组菌在转化过程中转化的底物木犀草素和产物3，-0.甲基化木犀草素在水溶液中的溶解度很低。添加一定浓度的助溶剂DMSO会提高底物和产物的溶解性，但高浓度的DMSO由于其本身的毒性作用会抑制大肠杆菌的生长速率。转化过程中不同添加量的DMSO研究发现，当DMSo的添加量为3%时，3，-O-甲基化木犀草素的产量较高，继续增加DMSO的量就会严重抑制大肠杆菌的生长,从而降低3O-甲基化木犀草素的产量，如图2-17所示。(qE).c2
10、xqowo,GDMSO(%)图2-17 DMSO浓度对转化的影响2.1.3 最适初始生物量ODeoonm对转化的影响初始生物量即转化开始阶段单位体积内的重组菌BL2I-PfOMT-SAMS-S的量，这一生物量对于木犀草素转化生成30-甲基化木犀草素起到很重要的作用。不同起始菌量下诱导转化，其3。O-甲基化木犀草素的产量影响如图2-18所示，研究发现起始菌量ODeoonm为1.4时，重组菌BL21-PFOMT-SAMS-S转化生成3。O-甲基化木犀草素的产量最高，含量可达到355mgL,之后菌体量的增加反而导致30-甲基化木犀草素的产量减少，分析原因可能是菌体老化、代谢产物的增多以及营养物质的消
11、耗促使3。O-甲基化木犀草素产量有所下降。图2-18起始菌量对转化的影响(rjaunUIpA3一；3OE2.1.4 底物浓度对转化的影响在不同的底物浓度条件下,3,-O-甲基化木犀草素的转化结果如图2-19所示。由图可知，当木犀草素浓度达到2g/L时，重组菌BL2I-PfOMT-SAMS-S中3,-0-甲基化木犀草素的生成没有受到木犀草素的抑制，转化木犀草素生成3，-0-甲基化木犀草素产量达到345mgL0并且木犀草素浓度越高，产物越多。初步分析重组菌BL2I-PfOMT-SAMS-S对底物木犀草素具有较高的耐受性。Lutcolin(gL)图2-19底物(木犀草素)浓度对转化的影响2.1.5
12、诱导时机对转化的影响通过诱导后不同时间添加底物进行转化，其产物3，-O-甲基化木犀草素的产量结果如图2-20所示。从图可得出在添加诱导剂IPTG培养3h后进行底物的转化可以使转化效率达到最高为412mgL,该产量为对照的121%。在诱导后3h内进行底物的转化其产物的量随着产酶的增加而增加，3h后添加底物进行转化,其转化率逐渐降低。O36912Inductionoccasiontime(h)图2-20诱导时机对转化的影响2.1.6 不同碳源对转化的影响转化过程中碳源主要为细胞生长提供能源ATP及用于各种转化所需因子重组酶及S-腺首甲硫氨酸等的合成。本试验以1%不同碳源的培养基进行木犀草素的转化，
13、其产物3:O-甲基化木犀草素的产量如图2-21所示，以甘油为碳源的TB培养基进行转化其3，-O-甲基化木犀草素的产量最高。当底物终浓度为800mg/L时，产物3O-甲基化木犀草素产量可高达423mgL0图2-21不同碳源对转化的影响2.2 最优转化条件下重组菌BL2I-PfOMT-SAMS-S转化合成3MD.甲基化木犀草素的研究以最优条件对重组菌转化木犀草素生成3，-0-甲基化木犀草素的时间曲线进行了研究，其3；O-甲基化木犀草素产量结果如图2-22所示，研究发现，重组菌转化开始的60h内产物3。0-甲基化木犀草素的产量一直在增加，在转化60h后3，-O-甲基化木犀草素的产量可达641mgL,
14、产率比为10.7mgLh,相应的摩尔转化率为76.5%o60h后3，-0-甲基化木犀草素的含量有所降低。32fu0nNhueQuo J3,-O-methyIluleolin-Iuteolin203040506070Time(h)图2-22重组菌转化木犀草素生成3，-O-甲基化木犀草素的时间图3结论重组质粒PCDFDuet-PFOMT和pACYCDuet-SAMS-S共转化大肠杆菌ExoliBL21(DE3)获得的重组菌BL2I-PfOMT-SAMS-S。对重组菌BL21-PFOMT-SAMS-S转化生成3O-甲基化木犀草素的条件进行了优化。重组菌转化利用甘油为碳源的TB培养基培养大肠杆菌，待菌浓OD600nm为1.5时进行诱导，添加0.2mM的IPTG在30C摇床培养3h后添加底物木犀草素以及3%的DMSO,0.3g/L的L-甲硫氨酸培养60h可以达到目前最高的甲基转化。在转化60h后3。0甲基化木犀草素的产量可达641mgL,产率比为10.7mgLh,相应的摩尔转化率为76.5%o60h后3；O-甲基化木犀草素的含量有所降低。
