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1、电泳技术,第一节前言,首次应用于生物学,首次称为电泳,一、电泳 历 史,1809年，俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验。显示了电渗透现象，为电泳理论和技术的发展奠定了基础。,电泳前,电泳后：阳极粘土颗粒上移，浑浊 阴极清澈，水面上升,Tiselius 电泳槽（C）和电极（V1和V2）,Tiselius和移动界面电泳,获诺贝尔奖，证明了血清是由白蛋白、球蛋白组成的。,移动界面电泳使解决生理学和医学问题达到了一个新水平！,电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。,例如蛋白质具有两性电离性质，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，反之则带
2、正电荷，向负极移动。当蛋白质溶液pH值与蛋白质的等电点相等，静电荷为零时则不移动。,二、电泳的分类（一）按分离的原理区分：电泳按分离的原理可分为4种，即区带电泳(zone EP，ZEP)、移界电泳(moving boundary EP，MBEP)、等速电泳(isotachophoresis，ITP)等电聚焦(isoelectric cusing，IEF)。,1、区带电泳 不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出个个互相分离的峰2、移界电泳 它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形。3、等速电泳 在电泳达
3、成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。4、等电聚焦 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。,（二）按有无固体支持物区分,根据电泳是在溶液中进行还是在固体支持物上进行，又可以分为自由电泳和支持物电泳两大类。自由电泳又可分为：显微镜电泳(也称细胞电泳)；移界电泳；柱电泳；自由流动幕电泳；等速电泳；,按有无固体支持物区分又可以分为:自由电泳和支持物电泳两大类,凝胶电泳,五十年代后，才开始固体介质电泳,使电泳技术得到了更快的发展
4、,总之，各种电泳技术具有以下特点：凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析；样品用量极少；设备简单；可在常温进行；操作简便省时；分辨率高。,一、Tiselius移界电泳法Tiselius的移界电泳法具有重要的历史意义，它的成功在于巧妙地解决了几个问题：能够形成清晰的起始界面；靠密度梯度能够稳定界面；能良好的散热；在泳动过程中可用光学方法显示其组分。,第二节 常用的电泳技术,二、区带电泳,1、滤纸及醋酸纤维素薄膜电泳它具有简单快速等优点：电泳区带界限清晰；通电时间较短(20min至1 h)；对各种蛋白质基本无吸附，因此无拖尾现象；不吸附染料，显示电泳区带背景干净。,2、高
5、压电泳高压电泳适用于分离低分子物质，如氨基酸、肽、抗生素及其他有机和无机物。因为低分子物质易扩散，高电压可使其移动快，在短时间内达到分离，减少扩散的影响。,3、连续电泳用一张垂直悬挂的滤纸作支持物，由上方连续加样，缓冲液连续由上方流下来，电极加在左右两方，电场方向与液流方向垂直。分离的成分由下方分别以试管收集,4、凝胶电泳,（1）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D半乳糖和3、6脱水L半乳糖结合的链状多糖,相关知识：影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素迁移速率由DNA的分子大小琼脂糖浓度DNA的构象所加电压电场方向碱基组成与温度嵌入染料的存在电泳缓冲液的组成等许多参数
6、确定。,琼脂糖凝胶电泳装置,实验步骤,制 胶,90以上熔化，凝胶温度35-43,EB,1、孔深 2、预留尺寸 3、梳子宽度 1+2=胶的厚度,3,加缓冲液,拔梳子,最好在电泳槽中,点 样,-,+,电 泳,紫外,电泳结果分析,DNA空间结构电压 EB,脉冲电场（PFGE）解决大分子DNA电泳问题,（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和 WeintraubL建立。1964年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等
7、生物大分子的分离和分析。,几个原理及名词：,凝胶原理,SDS作用与变性、非变性,连续与不连续,缓冲液,样品缓冲液,凝胶缓冲液,电泳缓冲液,1xSDS:50 mmol/L Tris-Hcl(PH6.8)100 mmol/L DTT2%SDS 0.1%溴酚蓝10%甘油,Tris 碱 用盐酸一次调PH成功0.1%SDS,1xTris 甘氨酸:25 mmol/L Tris250 mmol/L 甘氨酸(PH8.3)0.1%SDS,主要试剂及相关问题：,1、Acr 和 Bis 比例 29：1，此时分辨率最佳，凝胶成透明；Bis多硬无弹性。避光室温保存，隔几个月重配。神经毒！,2、SDS 电泳级 10%母液
8、，室温储备。刺激呼吸系统！,3、分离胶、浓缩胶的Tris 缓冲液 PH 6.8 PH 8.8,主要试剂及相关问题：,4、TEMED(四甲基乙二胺)通过催化过硫酸铵形成自由基，加速Acr Bis 聚合。低PH聚合反应受到抑制。吸入致命、挥发性强极其易燃，周围不得有明火！,5、过硫酸铵 提供引发聚合反应的自由基。10%4保存，每周新配！,6、Tris-Gly Buffer 安全！,凝胶浓度及其分离范围,SDS-PAGE 电泳装置,实验步骤,安装玻璃板,灌注分离胶,加水膜,约30min 后，胶凝聚后用水清洗几遍！并吸干残存的液体,灌注浓缩胶,灌满！,根据需要插入不同的梳子,30min左右加电泳缓冲液
9、，再拔梳子！,拔梳子后形成点样孔,孔周围有膜，用针拨开,点样，电泳,-,+,蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法。,染 色,染色液配制：0.1%考马斯亮蓝R250(先用甲醇充分溶解)50%甲醇 10%冰乙酸 40%蒸馏水 滤纸过滤,脱色液配制：10%甲醇 10%冰乙酸 80%蒸馏水,5倍体积染色4小时以上，脱色摇床，中间更换几次脱色液,硝酸银染色,银染的机制:来源于摄影银染技术,是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。优点:检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高50-100倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而且所需的上样量较少(每点仅需0.1)
10、。缺点:可重复性差 耗费人力 质谱测定有一定的干扰,染色方法,化学显色,光显色,双胺染色,非双胺 染色,是利用氨水同硝酸银进行反应产生银-双胺络合物,将固定后的凝胶浸泡其中,再通过酸化使其显色,是将固定好的凝胶浸泡于酸性的硝酸银中,在硝酸银和蛋白质发生作用后在碱性条件下,用甲醛还原使其显色。,是使用光能还原银离子成金属银。因为光能够在酸性PH还原银,所以一旦凝胶被固定,光显色能使用单一染色溶液,而不像化学染色程序那样通常需要两种溶液。,硝酸银染色,聚丙烯酰胺凝胶的主要优点：分辨率高。具有三种效应：浓缩效应，分子筛效应，电荷效应；长度仅仅相差0.2(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分开所
11、能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶；从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高。可根据被分离物质的分子大小控制凝胶浓度制成不同孔径的凝胶。丙烯酰胺较稳定，无色透明，机械强度好，易观察，可用检测仪直接测定。,凝胶干燥技术凝胶扫描技术借助薄层扫描仪对电泳图谱扫描，以迁移率为横坐标，以吸光度为纵坐标，将电泳条带转换成峰图。凝胶成像技术通过图像采集和图像分析，利用计算机程序自动识别图中所有可能条带。凝胶印渍转移技术Southern Blot，Northern Blot，Western Blot,5.电泳相关技术,A:GIS暗箱B:高分辨率数码相机C:安全门锁 D:GIS暗箱控制面板 E:PC机控制 F:紫外或白光投射仪 G:GIS 1D分析软件 H:数码热升华图片打印机,
