微生物的检测.pptx

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1、化验员培训 食品微生物检验,微生物定义、共性、分布,微生物：一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。它们都是一些个体微小（一般0.1mm）、构造简单的低等生物（单细胞或结构较为简单的多细胞生物、甚至没有细胞结构的生物）。微生物的五大共性：1.体积小、面积大 2.吸收多、转化快 3.生长旺、繁殖快 4.适应强、易变异5.分布广、种类多。微生物的分布：1.土壤 2.水 3.空气,检验依据的标准,GB/T 20977-2007 糕点通则：本标准适用于中式糕点产品的生产、检验和销售，本标准不适用于裱花蛋糕和月饼。,检验依据的标准,GB 17401-2014 食品国家标准膨化食品：本标准适用于预包装膨化

2、食品。,检验依据的标准,GB 19300-2014 食品安全国家标准 坚果与籽类食品：本标准适用于生干和熟制的坚果与籽类食品。,检验依据的标准及方法,生产车间现场涂抹实验菌落总数检验依据GB/T 18204.32013中华人民 共和国 国家标准 公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物 中3.3自 然沉降法。将营养琼脂平板暴露在空气中，微生物根据重力作用自然沉 降 到平板上，经实验室培养后得到菌落数的测定方法。大肠菌群检验依据GB14934-94食（饮）具消毒卫生标准，用食（饮）具 快速检测纸片进行取样、培养观察。将接种好的纸片放入37培养16 18h。纸片呈均匀紫蓝色为阴性；纸片变黄，在黄色

3、背景上出现红色斑 点或片状红晕为阳性。,检验依据的方法,产品清单,出厂成品 OEM半成品及成品 生产车间现场涂抹、食堂餐具及菜 原辅料、包辅材料 研发实验策划保质期产品,实验的仪器、设备、材料,恒温培养箱：361，281。冰箱：25 天平：感量为 0.1 g。净化操作台恒温水浴箱：46 1无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL。放大镜或/和菌落计数器/显微镜无菌培养皿：直径 90 mm高压灭菌锅蒸馏水器酒精灯、灭菌试管、灭菌镊子、灭菌剪子等。无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液 器及吸头,实验药品,备注:氯化钠AR药品用于配制0.

4、85%生理盐水。,实验操作步骤,1 实验开始前的准备1.1实验前要按照相应培养基的配方配制培养基并在高压蒸汽灭菌锅内121 灭菌15min。（结晶紫中性红胆盐琼脂培养基除外）1.2 将实验所要用到的生理盐水、培养皿、移液管（移液枪头）准备好并灭菌。1.3 将无菌间、超净工作台的紫外灯打开杀菌3040min。样品前处理 在酒精灯火焰旁，用被火焰灼烧灭菌后的剪刀剪开样品包装袋，称取25g样品置盛有225ml生理盐水的无菌杯内，轻轻震摇，制成 1:10 的样品匀液。,注：1.结晶紫中性红胆盐琼脂培养基要现配现用，煮沸不得超过2min,要在3h内 使用完。2.制备的样品匀液要在15min内完成接种,菌

5、落总数操作步骤(GB 4789.2-2010),菌落总数检验程序图,菌落总数操作步骤(GB 4789.2-2010),3 样品的稀释 3.1 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于 盛 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 样品匀 液。3.2 按 3.1操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释 一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。4 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体 样品可包括原液），在进行 10 倍

6、递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液于无菌平 皿内，每个稀释度做两个平皿。（目前，化验中心成品样使用10-1和10-2两 个稀 释度，食堂菜样使用10-2和10-3两个稀 释度）同时，分别吸取 1 mL 空白 稀释液加入两个无菌平皿作空白对照。,及时将 15 mL20 mL 冷却至 46 的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 1 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合 均匀。6 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 1 培养48 h2 h。菌落计数：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相 应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。7.1 选取菌落数在 30 CF

7、U300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU的平板记录具体菌落数，大于 300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。7.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生 长的 平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落 分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。7.3 平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计 数。,菌落总数操作步骤(GB 4789.2-2010),8 菌落总数的计算方法8.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计

8、算两个平板菌落数的 平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g样品中菌落总数的结果。8.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下列公式计算：N=C/（n1+0.1n2）d式中：N 样品中菌落数；C 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1 第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2 第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d 稀释因子（第一稀释度）。,例题：某微生物试验室对一食品样品进行菌落总数测定时，做了1：100和1：1000两个稀释度的样液，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入两个无菌平皿内，同时分别取1ml稀释液加入两个无菌平皿做空白对照。并及时将冷却至46的平板计数琼

9、脂15ml20ml倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。琼脂凝固后，将平板翻转，置于361培养48h，每个平皿的菌落数统计如下。根据上面平板菌落数计算该样品的菌落总数是多少？,菌落总数结果与报告(GB 4789.2-2010),答：该样品的菌落数=C/（n1+0.1n2）d=（232+244+33+35）/2+（0.12）0.01=24727 25000（cfu/g）,菌落总数结果与报告(GB 4789.2-2010),1.4 菌落总数的报告1.41 菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。1.42 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原

10、则 修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式 来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。1.43 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。1.44 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。1.45 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。,霉菌酵母菌操作步骤(GB 4789.15-2010),霉菌和酵母计数的检验程序图,霉菌酵母菌操作步骤(GB 4789.15-2010),3 样品的稀释同菌落总数方法，根据对样品污染状况的估计，选择 2 个3 个 适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀

11、液于 2 个无菌平皿 内。同时分别取 1 mL样品稀释液加入 2 个无菌平皿作空白对照。4 及时将 15 mL20 mL 冷却至 46的或孟加拉红培养基(可放置于461 恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。5 待培养基凝固后，将平板倒置，281培养 5d。6 菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌 落形成单位（CFU）表示。选取菌落数在 10 CFU150 CFU 的平板，根据菌落 形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。,霉菌酵母菌操作步骤(GB 4789.15-2010),7

12、结果与报告7.1 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。7.2 若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其 他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.3 若所有平板上菌落数均小于 10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以 稀释倍数计算。7.4若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算；如 为原液，则以小于 1计数。,霉菌酵母菌结果与报告(GB 4789.15-2010),7.5 报告7.5.1 菌落数在 100 以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。7.5.2 菌落数大于或

13、等于 100 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用0 代替位数来表示结果；也可用 10 的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。7.5.3 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告，报告或 分别报告霉菌和/或酵母数。,大肠菌群操作步骤（GB/T 4789.3-2003),大肠菌群检验程序图,大肠菌群结果与报告（GB/T 4789.3-2003),样品的稀释同菌落总数方法，根据对样品污染状况的估计，选择 3 个适宜 稀释度，每个稀释度接种三管。4 乳糖发酵实验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度

14、接种三管，置361 恒温箱内培养24h2 h，如所有发酵管都不产气，则报告大肠菌群阴性，如 产气，则进行分离培养和证实实验。5 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置361恒温箱内培 养24h2 h，观察菌落形态。6 证实实验 挑取上述可以大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361恒温箱内培养24h2 h，观察产气情况，凡乳糖管产气、革兰 氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告大肠菌群阳性。,大肠菌群结果与报告（GB/T 4789.3-2003),7 报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，根据GB/T 4789.3-2003中第5页的大肠菌群MPN检索表，报告每

15、100ml(g)大肠菌群的MPN值。,注：1.本表采用三个稀释度1ml(g)、0.1ml(g)、0.01ml(g)，每稀释度三管。2.表内所列检样量如改用10ml(g)、1ml(g)、0.1ml(g)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.1ml(g)、0.01ml(g)、0.001ml(g)时，则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。,大肠菌群操作步骤（GB 4789.3-2010第一法),大肠菌群MPN计数法程序图,大肠菌群操作步骤（GB 4789.3-2010第二法),大肠菌群平板计数法检验程序图,大肠菌群操作步骤（GB 4789.3-2010第二法),3 样品的稀释按菌落总数方法中的步

16、骤进行。4 选取2个3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。及时将15 mL20 mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于 每个 平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加 3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。凝固后翻转平板，置于36 1 培养18 h24 h6 平板菌落数的选择 选取菌落数在 15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑 大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm 或更大。,大肠菌群结果与报告（GB

17、4789.3-2010第二法),7 证实试验 从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 1 培养 24 h48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。8 大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以6.0中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4 样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/1010 4/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL）。

18、,注意事项（前处理）,1.称量培养基,2.培养基加热煮沸,3.包扎平皿,4.浸泡样品生理盐水准备,5.稀释样品生理盐水准备,6、培养基工辅器具等灭菌,8.瓶皿烘干备用,9.灭菌后盐水缸传入无菌间,注意事项（检测过程）,1.实验前空气杀菌,2.更换无菌衣帽鞋套,3.将手部清洁、消毒,4.剪刀用前消毒,8.样品浸泡、平皿标号,注意事项（检测过程）,9.无菌台酒精擦拭,10.选择适宜稀释度接种,11.倾倒培养基,12.培养基冷却凝固,13.第二次倾倒培养基,14.培养皿倒置于培养箱,15.培养箱培养,16.观察结果，记录数据,交流检测过程遇到的问题,交流检测过程遇到的问题（常见菌落形态图）,图1：菌落总数在平板计数琼脂上典型特征,图2：霉菌和酵母菌在孟加拉红培养基上典型特征,图3：霉菌在孟加拉红培养基上典型特征,图4：大肠菌群在结晶紫培养基上典型特征,交流检测过程遇到的问题（常见菌落形态图）,图5：大肠菌群在伊红美兰培养基上典型特征,图6：大肠菌群在月桂基培养基产气状况,图7：大肠菌群快速检测纸片典型特征,