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1、研究背景,样本的采集、处理 样本的保存 样本的运输 DNA的提取 RNA的提取,研究背景,一、样本的采集、处 理、保存及运输,临床标本的正确采集、运送、保存的重要性,临床检验的质量保证关键性环节解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一,（一）、样本的采集,地贫检测样品采集：外周血:5mL 脐带血:0.51mL 羊 水：2030mL 绒 毛：15mg 唾 液 组 织,标本采集的注意事项,所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则下进行已采集标本都应置于防漏、密封的无菌容器中运送采集足够量标本每份标本都应标记患者姓名、送检号码、标本来源、具体部位、日期、时间及相关临床信息,全 血,以全血
2、作为待测标本时，必须注意抗凝剂的选择，一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠，不可使用肝素全血样本如用于DNA提取检测，可4下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA,血清（浆）,DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（12周）保存可在-20下，较长期保存应在-70下,肝素的作用机理,肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯
3、化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用每g核酸标本中加入0.1U的肝素，即可100%的抑制酶活性在标本中加入肝素酶I 或13 U/g核酸在于5 mM Tris pH7.5,1 mM CaCl2,40 U RNasin 25 下作用2小时可去除肝素的抑制作用,（二）、样本的运送,样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室样本中如加入了适当的稳定剂，如用于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄建议：将全血标本或DNA样本用冰袋加泡沫盒快递运送。如需提取RNA的样本需预处理后加lml Tri
4、zol在低温运送,（三）、样本的保存,常规外周血标本，采集后做血常规，常温24小时内，4可保存1周；做血红蛋白电泳常温1周，电泳4可保存15天；DNA提取样本常温24小时，4保存1个星期，20 保存3个月，70 保存半年3年；RNA提取样本常温6小时，4保存12小时，70 保存3个月，羊水在12小时内离心可保存同上。,研究背景,二、核酸的提取,核酸提取的重要性,核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分，亦是手式操作的主要部分核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否临床PCR检验操作中最易出问题的环节,（一）、提取核酸总的原则,保证核酸一级结构的完整性；其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子
5、的污染应降低到最低程度；核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其他核酸分子，如提取DNA中的RNA，也应尽量去除。,（二）、核酸提取的基本步骤,1、核酸的释放：破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应最广泛的方法）,各种组织细胞破碎方法,2、核酸的分离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液,3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤,4
6、.核酸的鉴定 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定,浓度鉴定,DNA：1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。如计算DNA浓度 A260稀释倍数50 g/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。,(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸）,RNA：,紫外吸光光度法:A260稀释倍数40 g/ml(OD260-OD320)稀释倍数40 g/ml,2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析（1-5ng）,EB与DNA的结合
7、,纯度鉴定,紫外分光光度法：在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA A260与A280之比应在1.80(1.601.80)，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量纯的RNA A260与A280之比应在2.0(1.802.00),Ratio2.2:RNA可能已经水解成单核苷酸,A260/A280比值是纯度检测的重要指标！,注：测定吸光值，稀释液应使用,完整性鉴定,凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。,DNA完
8、整性鉴定：,正常时，28S RNA的荧光强度约为18S RNA的2倍，否则提示RNA的降解,RNA完整性鉴定：,5、核酸的贮存DNA保存,1）短期贮存：4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2）长期贮存：TE缓冲液中-70保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。,核酸的贮存RNA保存：,RNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水，在-70保存。RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-20 保存。RNA如果以DEPC（焦碳酸二乙酯）可以
9、抑制RNA酶对RNA的降解,三、基因组DNA的分离与纯化,（一）、DNA样品准备,常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 70或液氮,DNA提取前样本采集、预处理和保存：,全血 抗凝剂：EDTA-Na2 或枸橼酸钠 作为抗凝剂 不宜使用肝素,（二）、DNA提取,（一）酚抽提法：先用EDTA、SDS、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100150kb。,酚抽提法提取步骤：,DNA酚抽提法示意图,主要试剂的作用：EDTA：1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2.降
10、低细胞膜的稳定性,SDS的作用：1.溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来3.对RNA、DNA酶有抑制作用4.与蛋白质形成R-O-SO3.R蛋白质复合物，使蛋白质变性,蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用,苯酚：蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性苯酚溶于有机溶剂，微溶于水提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率氧化苯酚会破坏DNA,DNA的沉淀：,1）无水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等盐离
11、子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。2）异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子,（二）甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。,（三）磁珠法：磁珠在高盐低pH值下吸附核酸，在低盐高pH值下与核酸分离，再通过移动磁珠来获取D
12、NA,（四）微柱法：利用DNA在高盐、低pH的特定溶液环境下可吸附在固相介质（如硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中,（三）、DNA的浓缩,固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋 外敷PEG至合适量丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积,（四）、DNA回收,主要是从电泳中分离回收DNA片段回收原则：尽量提高回收率 去除回收DNA样品中的污染物,DNA降解的原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因组DNA盐浓度过高 基因组DNA中乙醇未清除净 基因
13、组DNA中可能存在其他抑制因素提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因 加入多糖，保护DNA长度,影响DNA质量的因素,四、RNA的分离与纯化,（一）、样本来源,理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取RNA样本选择取决于试验目的全血是基因组提取RNA最常见的样本,每个细胞的RNA量约为10-5 g 80%-85%rRNA 10%-15%tRNA 1%-5%mRNA 其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA,（二）、RNA提取的独特性关于RNase酶,临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活如何避免RNase对标本的污染及防止
14、RNase对提取的RNA的降解,是保证RNA成功提取的关键之所在,RNase酶,RNA易被RNase水解，RNase除胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中RNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复,去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性,1.内源性RNA酶（intrinsic RNase）,2.外源性RNA酶(extrinsic RNase)主要来源：被污染的缓冲液 细菌或微生物污染，高压不能去除RNA
15、酶 自动移液装置,3.实验室采取避免RNA酶污染的措施设置专门RNA移液装置小份保存缓冲液设置专门的RNA电泳装置准备溶液或缓冲液时，使用无RNA酶的器皿、DEPC处理水等分离RNA过程中使用RNA酶抑制剂,4.RNA酶的去除,DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。,O,C-CH2-CH3,O,C-CH2-CH3,O,=,=,DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37C处理1h或室温下过夜。,DEPC非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相
16、容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用DEPC,5.RNA提取所用器皿的处理,经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管,离心管等基本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA 实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于180干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰,6.RNA提取所用
17、溶液的准备,对于RNA提取所需溶液的配制,必须用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNase的玻璃器皿。可能的话,溶液均应用0.1%DEPC于37至少处理12小时,然后于100加热15分钟或高压蒸汽灭菌15分钟须注意的是,DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液,因此可存几瓶新的,未开封的Tris试剂以制备无RNase的溶液,7.RNA提取中RNase 污染的控制,实验操作人员的手是RNase污染最主要的潜在来源。策略是：在准备用于RNA纯化的实验材料和溶液时,以及在涉及RNA的整个提取操作过程中,都应戴一次性
18、手套在RNA提取实验中，应勤换手套,（三）、用于提取RNA的血样的处理,取新鲜抗凝血23ml入15ml无菌塑料管，600g离心5分钟，弃上清。加入6倍细胞体积的红细胞裂解液（约12ml），轻轻吹打混匀，本步骤在室温或4度操作均可。裂解时间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。600g离心5分钟，弃红色上清。4离心效果更佳。一般情况下，裂解1次红细胞应该裂解的差不多，如果有较多红细胞没有裂解的话，可以再加点红细胞裂解液约5ml裂解1次。步骤同3。向得到的细胞团中加Trizol 1.0ml，弹匀，将细胞团打散，转入1.5ml无菌塑料管，封好盖。标上号，缠上封口膜，20 或70
19、 保存。,（四）、RNA提取的常用方法,表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法胍盐提取结合氯仿-酚抽提法胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等,RNA提取实验前的准备,【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，则使用0.1%DEPC水溶液在37处理12h，后120高压30min，去除残留DEPC【试剂配制】无菌水须用0.1%DEPC处理后高温高压灭菌 RNA实验试剂应RNA提取专用，避免其他试剂交叉污染【其他】实验过程中使用一次性手套，并经常更换；在RNA专用区操作，操作过程中避免交谈,表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法：,每mg组织中加入1mlTrizol试剂，高速破碎组织
20、（使用高速组织捣碎器）加入氯仿0.2ml,轻轻颠倒混匀，室温静置分层。高速离心12000rpm，4-8 C，10分钟吸上清液至新离心管中，约600ul加入500ul异丙醇，混匀，室温静置10分钟高速离心12000rpm，4-8 C，10分钟弃上清液，沉淀为RNA加入1mlDEPC处理的75%乙醇，混匀，7500rpm离心，4-8C，5分钟加入DEPC处理水30ul，混匀，55-60 C水浴3ul加入297ulDEPC水，测定浓度和纯度,异硫氰酸胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取法,试剂的作用：,加入-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活,（四）、mRNA的分离纯化,除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3末端带有长短不同的poly（A）尾巴利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA,The End!,
