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1、一、实验目的,学习PCR反应的基本原理与实验技术从BCG基因组DNA中PCR扩增Rv1791(PE19)基因,二、基本原理,PCR类似于DNA的天然复制过程。将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两段寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增倍数可达2n倍。,体内DNA的复制,DNA的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,总体积
2、 25-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶,1 反应体系,三、实验材料,BCG基因组DNA10PCR反应缓冲液、4dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物(P1、P2)、超纯水SWPCR反应管、移液器、PCR仪、离心机,四、实验步骤,引物设计准备PCR反应溶液PCR扩增反应结果检测,Rv1791-F:ATGAATTCAGGAAGACAGCATGTCGTTC(EcoR I)Rv1791-R:ATCTCGAGTGTTCCCCCTCTCCTTCAG(XhoI),(二)准备PCR反应溶液,10PCR反应缓冲液 2.5
3、l 4dNTPs 2.0l 引物P1 1l(10nM)引物P2 1l 模板DNA 2l Taq DNA聚合酶 0.2l 用无菌去离子水至 25l 用手指轻弹PCR反应管管底部,使溶液混匀 在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底,在PCR仪中设计如下反应程序:94C、5min;94C、30sec,61C、40sec,72C、30sec,30个循环;72C、5min,(三)PCR扩增反应,将已混匀的PCR反应管置于PCR仪的反应孔中,盖好盖子,进行反应。反应完毕,将样品取出置于冰浴中待用,(四)结果检测,本PCR扩增的产物DNA片段长度为300bp,适合于在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。从每个反应管中取5ul PCR产物进行电泳检测。,五、思考题,影响PCR结果的因素。,