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1、球菌,杆菌,弧菌,实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色,一、实验目的1.学习掌握单染色的操作技术和无菌操作技术。2.了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。,二、实验原理-简单染色,细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背
2、景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。,二、实验原理-简单染色,染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形。,二、实验原理-革兰氏染色,革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰
3、氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。,二、实验原理-革兰氏染色,革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。,二、实验原理-革兰氏染色,当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不
4、同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。,三、实验器材,1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌斜面菌种。2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅。3、草酸铵结晶紫染色液、卢
5、戈氏碘液、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双层瓶（香柏油和二甲苯）。,四、实验方法和步骤,细菌的简单染色1、涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂面染色1-2分钟。5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）。6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。7、镜检：油镜观察并绘图。,四、实验步骤,1、菌落形态观察：2、细菌简单染色：3、细菌革兰氏染
6、色。,注意：菌落颜色、湿度、形状、大小、透明度、颜色、边缘是否规则等特征。,染色过程：涂片干燥固定染色（1min）水洗干燥镜检注意事项：涂片：取菌量不能太大 干燥：自然干燥 水洗：水流不能直接冲在涂菌处,2.革兰氏染色,1）、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端1/4处下面用记号笔分别标明S和E（见图示），并滴一滴蒸馏水，分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌涂布在相应的区域内。,2.革兰氏染色,2、干燥与固定：方法同（一）中2，3步骤3、染色：结晶紫染色1-2分钟-水洗-碘液媒染1-2分钟-水洗-酒精脱色15-20秒-水洗-番红复染色2-3分钟-水洗-干燥-镜检记录。,染色结果,金黄色葡萄球菌革兰氏染色
7、结果,染色结果,大肠杆菌革兰氏染色结果,染色结果,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果,四、实验结果,绘图记录观察结果,显微镜放大倍数物镜放大倍数目镜放大倍数,思考题,1、在制作涂片中，为什么要进行固定这一步？2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？,附：油镜的使用,双目显微镜,单目显微镜,2.油镜的原理,油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时，因介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至因折射而减弱，因此能清楚地看到物象。,双层瓶,香柏油,二甲苯,下一个实验,实验三、学校公共环境微生物的分离与纯化,
