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1、水稻普通矮缩病 Rice dwarf,小麦黄矮病 Wheat yellow dwarf,水稻黄萎病,玉米黑条矮缩病,灰稻虱,番茄病毒病（卷叶）,豇豆病毒病,西瓜病毒病,马铃薯病毒病,白菜病毒病,植 物 病 毒,经济作用：绿菊花、郁金香、日本卫矛 增 产 菊芋潜病毒 莴苣巨脉病毒 樱属环斑病毒,植 物 病 毒,植物病毒的特殊性：亚显微性病毒粒子微小隐蔽性一般无肉眼可见的病症潜伏性有隐症现象微量性病株体内病毒浓度低，且分布不均,第八章 植 物 病 毒,一、植物病毒病的症状二、植物病毒的生态学三、植物病毒的传播四、植物抗病毒防卫反应的原理五、植物病毒病的防治六、植物抗病毒基因工程 七、植物病毒的检测
2、八、植物病毒的纯化、提纯与保藏,本章要点 植物病毒病的症状及其特点 植物病毒传播 病害防治原理与方法,一、植物病毒病的症状,症状有诊断价值，区别生理性病害、遗传病害、病毒病害病毒性病害（1）田间发病一般分散，少数土传的可小片发生，但极少普遍发生与昆虫介体、接触传播有关（2）可传染性，借助介体或其它传染方式传播植物病毒病研究中，一般进行生物学测定、传染试验，再做电镜观察,一、植物病毒病的症状,1、宏观症状macroscopic symptom生长减缩(Reduction of growth)变 色discoloration：叶、花、茎、果实及种子坏死necrosis畸形生长malformatio
3、n失水2、微观症状microscopic symptom,类型：症状symptom与病象syndrome(多种症状的总称）,一、植物病毒病的症状,1、宏观症状macroscopic symptom(1)生长减缩(Reduction of growth)：矮缩dwarfing、矮化 stunting、小实small fruit、小叶 little leaf、缩根 root reduction,大蒜病毒病,矮化Stunting,矮缩Dwarfing,一、植物病毒病的症状,1、宏观症状macroscopic symptom(2)变 色discoloration 叶变色 褪绿 chlorosis、白化
4、 blanching、紫/红/黄化 purpling/reddening/yellowing、褐/黑/古铜化 browning/blackening/bronzing 脉明症vein-clearing、杂色variegation、花叶mosaic、斑驳mottling、斑点spoting/doting、线纹line pattern、环纹ring stripe、条纹stripe、环斑ring spot、条斑streak 沿脉变色vein-blanding、脉间花叶interveinal mosaic叶绿素、胡萝卜素、花青素（红到紫）,Tobamovirus,Mosaic symptoms on
5、tobacco caused by TMV,斑驳Mottle,TMV transmission by an Apis sp.,A severe mosaic symptom on tomato leaf(TMV),腿色斑Chlorotic spoting,黄化Yellowing,斑驳Mottle,脉明症Vein-clearing,条斑Leaf streak,腿色斑驳Chlorotic mottle viroid,yellow dwarf,变色,seed coat mottling,郁金香碎锦花叶病,花变色碎色症color breaking、花瓣变绿virescence,杂色花郁金香、香石竹、紫
6、罗兰、虞美人、唐菖蒲,(3)坏死necrosis 枯斑necrotic spot、线条坏死streak necrosis、死顶top necrosis、蚀纹etch(不规则的线纹),一、植物病毒病的症状,辣椒病毒病,马铃薯病毒病,necrosis symptoms on tomato caused by TMV,Local lesions in tobacco one week after inoculation with TMV,一、植物病毒病的症状,(4)畸形生长malformation：,耳突enation溃疡性肿瘤cankerous肿枝shoot swelling扁枝症branch f
7、lattening蕨叶症fern leaf线叶症leaf narrowing皱缩crinkling曲叶leaf curl花束症boguet,束顶症bunchy top叶片偏上性epinasty卷叶leaf rolling丛枝症witchs broom拐节症zigzag growth花器变态antholysis绿花virescence变叶phyllody缩节apostasis不孕性sterility,卷叶Leaf rolling,芹菜,耳突Enation,畸形,脉明症vein-clearing,茎瘤,畸形,Healthy(left)and naturally mop-top affected(r
8、ight)plants of potato,蕨叶症fern leaf,西葫芦疱斑畸形,畸形,丛枝症 拐节症witchs broom zigzag growth,畸形,Peach leaf distortion,畸形,萎蔫wilting,(5)失水：萎蔫wilting 过量蒸腾overtranspiration 病毒本身阻塞导管、胶质、形成侵填体堵塞导管,一、植物病毒病的症状,2、微观症状microscopic symptom,组织病变：callose、侵填体tylose、流胶gummosis 正常组织增生hyperplasia 增大hypertrophy 可染色检查抑制木质素形成(inhibi
9、tion of lignin formation)内含体 inclusion:柱状、风轮状pinwheel、卷筒状scroll、晶状等,局部症状local symptom系统症状systemic symptom,外表症状的隐潜masking：,无症侵染symptomless infection高温隐潜high temperature masking获得免疫acquired immunity hypersensitive response HR砧木的作用 Stock effect,一、植物病毒病的症状,二、植物病毒的生态学,Virus pathoecosystem,二、植物病毒的生态学,(一)、
10、生物因素1、病毒及其寄主植物 栽培植物的种及品种改变 野生植物及杂草是病毒的贮源2、传播介体与病毒的扩展3、人和动物的传播4、栽培措施与病毒病的关系,生态系统中，各种因素相互制约，维系着平衡状态，不要随意打破。澳大利亚包心莴苣坏死黄化病毒，其毒源植物是野生的苦苣菜(sonchus)野兔多，引进粘液瘤病毒控制野兔苦苣菜过多包心莴苣坏死黄化病毒毒源多莴苣病毒病大发生,二、植物病毒的生态学,(二)、环境因素,土壤状况：N、P、K含量与比例、土壤温度、湿度、土壤类型气象因素：降雨、气温、风等影响气传和土传病毒介体的繁殖、传播速度等,二、植物病毒的生态学,三、植物病毒的传播,transmission(b
11、etween plants),三、植物病毒的传播,三、植物病毒的传播,非介体传播：植物病毒从寄主体上，由于伤残或分泌而达到体外，与另一寄主体通过微伤口接触而传染，或通过寄主细胞间的有机结合而传染。介体传播：病毒依附在其它生物体上，借其它生物体的活动而进行传播、感染。,（一）、非介体传播,1、机械或汁液擦伤传染2、种子传染(1/10)3、无性繁殖材料4、土壤传播5、菟丝子(Cuscuta)传染6、嫁接传染,（一）、非介体传播,2、种子传染(1/10)病毒在种子中 的分布：（1）病毒不能进入胚，在胚外，种子污染；（2）病毒可进入胚，但进入后是否被寄主 消 灭决定是否种传 病毒能否进入胚受病毒基因控
12、制病毒种传机理：（1）由带毒母体直接侵入种胚（2）间接从生长点、茎尖侵入胚（3）通过异花授粉使带毒花粉从外部经柱头 侵入健株的胚,在胚外outside the embryo,传播率低：种子成熟经过脱水、收获、贮藏；有些接触不到幼苗；有些存在于胚乳内。在胚内within the embryo：真正意义上的种传,（一）、非介体传播,2、种子传染seed-transmission病毒种传的重要性（1）早期提供毒源，引起病毒病流行 种子带毒后，直接使幼苗发病，为大田侵染提供了初侵染源（2）远程传播 通过种子进出口、种子 调拨使病区扩大花粉能传毒，种子一定能传毒,（一）、非介体传播,3、土壤传播soil
13、-transmission病毒进入土壤的途径：（1）病残体带入（2）病株根部渗入土壤土传病毒病害的特点：（1）病害开始往往局限于小块发病中心（2）传播速度慢（3）土壤传染性可长期保持（4）干燥丧失传染性-线虫传，否则真菌传,（一）、非介体传播,4、菟丝子传染Cuscuta可将复合感染的病毒分开5、嫁接传染顶接、侧接、靠接、套接受接穗和砧木亲和力影响会将病株中其它病毒也同时传播,(二)介体vectors传播,1、虫毒为害和真正的病毒病害的区别：虫 毒 病毒病害 0 1、昆虫分泌的对植物有毒物质 病毒所致2、毒素在植物体内不能增殖 病毒可在植物体内增殖3、中毒植物在一定情况下可恢复 极少能恢复4、
14、受害程度与昆虫饲食时间虫数 不成正比5、产毒能力有遗传性 只有少数能通过卵传6、无性繁殖材料或嫁接不传 可嫁接、无性繁殖材料传7、防治与控制昆虫效果成正比 常不成比例,主要介体有：昆虫、真菌、螨类、线虫类昆虫介体有：蚜虫、叶蝉、飞虱、甲虫、蓟马、粉蚧、蝽象等昆虫的传毒过程分为：获毒、潜育、传毒三个时期获毒饲育期（acquisition feeding period）指无毒昆虫开始取食至已获得传毒能力所需的时间接毒饲育期（inoculation feeding period）指带毒昆虫在健康植株上引起发病的取食时间。潜育期（latent feeding period）指昆虫从获得病毒起到能传播给
15、植物所需的时间。,(二)介体vectors传播,按昆虫获毒后能保持传毒的时间可分为：非持久性传播(nonpersistent)：口针传播，病毒在体内短期存在，几秒几分钟即可获毒并立即传毒，也易丧失传毒能力持久性传播(persistent):昆虫保持相对较长的传毒时间，数周数月，其病毒可分为：循回病毒circulative virus 增殖病毒propagative virus半持久性传播（semipersistent）,蚜虫传播（aphid transmission),在测定过的传病毒的242种昆虫介体中，已证明的介体有192种，其中蚜虫占173种。自然条件下多。可传CMV的有75种，桃蚜能传
16、100多种病毒为害农作物，难防治。蚜虫传有：非持久性 花叶、斑驳症状 口针被动的机械污染 主动吸食和回吐病毒半持久性持久性 病毒多在韧皮部增殖，不能经汁液摩擦接种,aphid transmission,Apterous(wingless)lettuce aphid,An alate(winged)green peach aphid,Whitefly Trialeurodes abutilonea 粉虱,Presence of bean leaf beetles can indicate virus risk,Leafhoppers,2、线虫传播 nematode transmission,长针
17、线虫属 Longidorus剑针线虫属 Xiphenema毛刺针线虫属 Trichodorus拟毛刺针线虫属 Paratrichodorus有十多种病毒可线虫传，有：番茄环斑病毒、雀麦花叶病毒、葡萄扇叶病毒、烟草环斑病毒、烟草脆裂病毒等一般都可经种子传线虫与病毒的特殊关系由线虫食道表皮膜蛋白与病毒的外壳蛋白之间的亲和性决定,3、真菌传播fungi transmission低等真菌：壶菌、根肿菌二种方式：(1)病毒粒子附着在游动孢子周身，鞭毛(2)病毒在休眠孢子中与休眠孢子共存 但都无证据表明病毒在菌体内增殖禾谷多粘菌Polymyxa graminis,Light micrograph show
18、ing resting spores of Olpidium brassicae,三、植物病毒的传播transmission,Virus transportMovement in plant,四、植物抗病毒防卫反应的原理（一）、防卫过程植物对病原微生物的抗性反应大致分为：组成型抗性 如表皮角质层、气孔大小等诱发型抗性根据寄主和病毒的相互作用，可将防卫反应分为三个阶段：侵染识别 防卫反应基因活化表达 枯斑产生,hypersensitive reaction(HR)systematic acquired resistance(SAR)广谱抗病性（可抗病毒、真菌、细菌等）Inducing inocu
19、lation 诱发接种challenge inoculation 挑战接种,四、植物抗病毒防卫反应的原理,防卫反应类型,1、免疫immune非寄主抗病性（non-host resistance)利用远缘杂交2、侵染性infectible局部坏死反应，同时诱发非专化寄主防卫反应、产生PR蛋白，之后寄主表现局部或系统获得抗病性,在防卫反应中被诱导的与抗病有关的物质,1、PR蛋白2、植物次生代谢产物：酚类、类黄酮、生物碱、抗生素类3、植保素(phytoalexin,PA)广谱性、非特异性，异黄酮类isoflavonoid4、多酚类化合物5、其它寄主蛋白和酶活性变化 过氧化物酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶
20、等,PR蛋白,病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins)1、低分子量（1245KD）2、抗蛋白酶水解3、酸溶性4、局部分布5、诱导产生大多数属于水解酶类，如chitinase,-1,3-glucanase等,返回,酚类化合物在植物抗病中的作用,1、多酚氧化酶和过氧化物酶等使多酚化合物 氧化，氧化产物对菌丝生长有抑制作用2、病原菌分泌细胞壁多糖降解酶，酚类可抑 制该酶类3、酚类是木质素的前体，酚类物质积累促进 木质素合成，使寄主细胞壁加固返回,植物防卫反应的激发,两类植物基因在起作用：植物抗病基因决定预先形成的抗病能力或使病毒失活的蛋白质、酶等多种因子植物防卫反应
21、基因植物抗病基因产物与病毒基因产物互作，诱导防卫基因表达植物抗病基因的克隆、抗病基因产物及其作用方式、植物防卫反应表达的调控等问题是当前植物抗病性分子生物学研究的热点,植物防卫反应的激发,病毒的外壳蛋白(CP)被认为是诱导寄主HR反应的激发子(elicitor)植物病原细菌的毒性基因主要有hrp和dsp基因 hrp(hypersensitive reaction and pathogenicity gene)控制在非寄主植物上诱导过敏性反应和在寄主植物上决定致病的基因，hrp基因编码的产物harpin可诱导非寄主植物产生HR，也是一类激发子。其它的激发子有：寡糖、多肽、水杨酸、茉莉酮酸等dsp
22、(disease specific gene)只与致病性有关的基因,五、植物病毒病的防治,病害三角：1、消灭侵染来源和传染介体2、改进植物品种的抗病及耐病性3、对已得病的作物寻找理化治疗方法,Pathogen,Environment,Host,原 理,（一）、清除传染来源种子：豆科、葫芦科、菊科等、留健种繁殖材料：苗木、接穗、砧木、块根等杂草、桥梁寄主污染病毒的土壤、病残体(如TNV,TMV)（二）、防止病毒传播 1、治虫：测报、大田诱杀、物理避虫、隔离栽培、调节播期、杀虫剂等,五、植物病毒病的防治,(二)、防止病毒传播2、预防接触传播：农事操作、工具等3、根靠接(果树)、花粉传播预防(三)、
23、选用脱毒种苗或无病毒种苗1、繁殖材料检验的索引法（indexing)2、病毒在植株体内的分布和组织培养(四)、化学防治(五)、交叉保护：弱毒株、卫星RNA等(六)、热处理(七)、抗病品种,五、植物病毒病的防治,马铃薯病毒病防治,优点：1、一旦相应病毒侵入，其卫星RNA就被激活、放大，植物细胞中只要有低浓度的RNA转录就行；2、卫星RNA给植物的抗性不会因为病毒接种量而克服；3、抗性的获得不产生新的异源蛋白，提高了转基因植物的生物安全性。缺点：1、只有少数病毒具有卫星RNA，大大限制了其应用范围；2、卫星RNA有可能被自然的病毒载体包装并释放到环境中；3、有些卫星RNA可能突变增强病毒致病力或者
24、和植物RNA重组，产生难以预料的病症，限制该技术路线的运用。,利用病毒卫星RNA使植物抗病毒,返回,选育抗病品种的一般程序,确定选育对象品种抗性测定（与病毒株系分化结合）根据本地品种和分离物的研究收集外地品种和病毒的分离物，比较反应差异引进该病毒国外所用的鉴别品种,（四）、化学防治,化学物质：金属盐类:ZnSO4 CaCl2 有机酸类:类黄酮、水杨酸、清洁剂（Tw80、Triton-100）嘌呤嘧啶类：三嗪类、8-偶氮鸟嘌呤 维生素类：VB2；植物激素类：赤霉素、激动素 蛋白质类 氨基酸类:牛奶、原亮氨基酸天然物质：多糖类 蛋白质类 糖蛋白类 蛋白多糖类 返回,抑制病毒侵染、病毒蛋白的合成 分
25、子量在1000055000Da,从微生物代谢产物中提取抗病毒抑制剂,六 植物抗病毒基因工程,复制酶介导的保护作用(Replicase Mediated Protection，RPMP)外壳蛋白介导的保护作用(Coat Protein Mediated Protection,CPMP)移动蛋白介导的保护作用(Movement Protein Mediated Protection,MPMP)病毒基因相关的其它序列介导的抗性 非病毒来源的基因介导的抗性,P315-319,(一)、复制酶介导的保护作用(Replicase Mediated Protection，RPMP)复制酶(RP)是指由病毒编码
26、的，能特异合成病毒+RNA、-RNA的RNA聚合酶，其核心功能是合成全长的病毒基因组RNA。1988年Van an等开始尝试将病毒的RP基因转入植物，目前RPMP已在至少13种病毒(分属10个植物病毒属)中进行研究。1）RP介导的抗性强 若产生抗性，能使转基因植物产生免疫或高抗。2)持续时间长 一般RPMP呈现持续抗性。,六 植物抗病毒基因工程,(一)、复制酶介导的保护作用(RPMP),3)作用范围相对较窄 RPMP一般对提供RP基因的亲本病毒株系有抗性，而对那些与亲本株系显示一定序列差别的同种不同株病毒不表现抗性。4)可诱导的抗性 组成型表达的RP基因介导的抗性绝大多数是预先建立的，一旦接种
27、病毒就会表现。但也有些表现为可诱导的抗性。5)抗性表现复杂 表现RPMP的转基因植株的原生质体均表现抗性，这种单细胞水平的抗性说明RPMP抑制了病毒在宿主细胞中的复制。有些限制病毒在细胞间的移动或通过维管束系统长距离迁移。,六 植物抗病毒基因工程,(一)、复制酶介导的保护作用(RPMP),RPMP的抗性机理：(推测的机理)依赖于基因沉默(gene silencing)的抗性机制 位置效应、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默 蛋白质介导的抗性：转基因表达的RP干扰了病毒复制和移动 形成RNA-RNA抑制双体：转基因转录产物和接种的病毒RNA间形成RNA-RNA复合体，影响了病毒RNA与各种
28、蛋白间的互作，从而干扰病毒侵染。转基因产物复制酶作为激发子引发宿主的防御系统反应 情况可能更复杂，涉及多种抗性机理同时起作用,六 植物抗病毒基因工程,(二)、外壳蛋白介导的保护作用(Coat Protein Mediated Protection,CPMP)研究最早、应用最多的植物抗病毒基因工程策略 自1986年成功获得TMV CP介导的抗TMV的烟草，到目前为止，已针对10多个属 30余种病毒进行了CPMP试验，转基因受体植物多达十几种，其中大多数转入CP基因的植株对同源性较高的同属大多数病毒有一定程度的抗病性，表现为症状减轻或延迟出现，或症状限于接种叶片不扩展到新生叶片，病毒含量低或测不到
29、。局限性：CPMP一般只是推迟发病，抗性主要表现在病毒侵染早期，一旦提高病毒接种量或重复接种则抗性破坏。目前倾向于把CPMP与其它抗性基因策略相结合。,六 植物抗病毒基因工程,(二)、外壳蛋白介导的保护作用(Coat Protein Mediated Protection,CPMP)CPMP机理：以前认为是CP干扰了病毒粒子侵染早期的脱衣壳过程，使其无法暴露出内部核酸，进而抑制在宿主体内的复制和增殖，故CPMP对接种病毒RNA无效。但越来越多的实验结果使情况变得复杂，发现CP可以影响病毒通过胞间连丝的移动，可能参与抑制病毒的长距离迁移，抑制病毒复制或作为激发子识别宿主抗性基因，引发HR(Hyp
30、ersensitive Response)。,六 植物抗病毒基因工程,(三)、移动蛋白介导的保护作用(Movement Protein Mediated Protection,MPMP)MP由病毒基因编码，负责参与病毒在寄主细胞之间传递和通过植物维管组织长距离迁移，从而导致寄主整体发病。只有当转基因植物表达的是失去功能的MP时，才能显示出抗性。而当转基因表达有功能的MP时，或者对病毒侵染无影响，或者反而提高植物感病性。用有运动缺陷的同源或异源病毒接种这种转基因植物，病毒能恢复正常的胞间转运甚至能在植物内长距离迁移，从而导致病害加重。它突出的优点在于广谱抗性。,六 植物抗病毒基因工程,(三)、移
31、动蛋白介导的保护作用(Movement Protein Mediated Protection,MPMP)MPMP机理属于蛋白质水平介导的抗性转基因表达的失去功能的MP与接种病毒的野生型MP竞争胞间连丝上的结合位点许多不同病毒的MP可能与相同的胞间连丝成分起作用(广谱抗性的例子暗示)也可能涉及病毒编码的蛋白、病毒基因组和寄主因子间的相互作用,六 植物抗病毒基因工程,六 植物抗病毒基因工程,(四)、病毒基因相关的其它序列介导的抗性 核酶(Ribozyme，Rz)和反义基因核酶是一种能特异切割RNA的RNA，依据已知的病毒基因组的特定区域序列设计Rz,使它能特异地识别、切割病毒的特定区域，从而切断
32、病毒基因组，破坏其生物功能。蛋白酶基因马铃薯Y病毒属的病毒编码的NIa(Nuclear Inclusiona)具蛋白酶性质，表达烟草脉斑驳病毒(TVMV)NIa的烟草能抗TVMV;表达PVY NIa的烟草能抗PVY。卫星RNA和缺损干扰RNA(Defective Interfering，DI)Sat-RNA一般与辅助病毒没有序列同源性，而DI-RNA与辅助病毒有序列同源性，利用Sat-RNA和DI-RNA均能达到干扰病毒复制、扩散及其它生物功能，从而减轻症状。,反义基因是与目的核酸序列(正链或负链)互补的反义序列，它可以抑制或封闭目的基因的复制、剪接和表达。表达PLRV、TEV、TGMV CP
33、基因的反义RNA的烟草对各自来源的病毒都显示了较强抗性。核酶和反义基因相结合有望达到更高的抗病毒效果。,六、植物抗病毒基因工程,(五)、非病毒来源的基因介导的抗性 来源于植物本身的抗性基因 植物抗体(Plantibody)基因核糖体钝化蛋白(Ribosome Inactivating Protein，RIP)2-5寡聚腺苷(2-5-oligo-adenylate,2-5)系统 2-5系统是高等脊椎动物的一种抗病毒机制，它包含 2个关键酶：2-5合成酶与依赖于2-5的RNase L，通过病毒侵染形成的dsRNA激活2-5系统，降解病毒RNA，从而阻止其复制及扩散。,六、植物抗病毒基因工程,局限性
34、与危险性应用前景瞩目，美国批准商业化应用的转基因植物有抗病毒西葫芦，番茄和番木瓜等，目前国内也有转基因抗病毒烟草、番茄和甜椒的产品获准商业化应用。研究方向用多种类型的抗性基因来获得广谱的、高程度的抗性。如作用于病毒侵染早期的CPMP，广谱的MPMP与作用于侵染后的RPMP相结合；开展基础研究，探讨抗性机理，以求更准确有效地导入合适的外源基因；揭示植物本身的防御机制以提高植物的内在抗性；用基因工程技术将综合性状，质量性状基因一起导入目的植物，再与常规育种相结合，培育抗病毒、高品质的新品种。,七、植物病毒检测的主要方法,生物学特性测定：在鉴别寄主上的反应、症状、传播等显微镜观察：内涵体、病毒粒子、
35、定位分布等免疫学特性测定：以血清学和组织免疫化学方法检测材料带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体分子生物学技术鉴定：核酸分子杂交、PCR等分子标记技术（AFLP、RFLP、RAPD）,生物学鉴定,依靠寄主植物和病毒的传播方式寄主病症、寄主范围、介体、交叉保护现象等依靠症状诊断不完全可靠：不同病毒在同种植物产生相同症状同种病毒在植物的不同栽培品种上症状不尽一致同种病毒的不同株系可产生不同症状复合侵染常有潜伏侵染不同土壤和气候条件可改变症状,鉴别寄主检验,马铃薯病毒在鉴别寄主上的症状表现 检验病毒 接种植物 检查时间 症状表现 PVX 千日红 57d 叶面有红色环形枯斑PVM 千日红 1224d 叶面
36、有紫红色小枯斑PVS 千日红 1425d 叶面有桔红色小枯斑PVG 心叶烟 20d 系统性白斑花叶PVY 普通烟 710d 明脉，后脉常花叶PVA 香料烟 710d 明 脉PSTV 莨 菪 510d 沿脉出现褐色环死斑,Testing for Soybean Viruses with Indicator Plants,HypersensitivitySome plants are predictably sensitive to a specific virus.The hypersensitive plants are called indicator plants,and are used
37、 as a bioassay to test for the presence of virus in an unknown sample,1,Materials:gloves,sterile cotton swabs,rinse bottle,tissue grinding bags and carborundum-silicon carbide which is used as a tissue abrasive,2,Plant sap is made from the plant to be tested for virus by pulling off a symptomatic up
38、per leaf,3,placing the leaf in a sterile plastic bag.adding buffer solution to the bag.grind the leaf tissue to release the virus particles into the buffer.,4,sprinkle a bit of carborundum on the plant to be inoculated.Just a light dusting is sufficient to provide enough abrasion to introduce virus
39、into the plant cells.,5,inoculate the indicator plant,a cotton swab is immersed in plant saprub the surface of the test plant leaf firmly,but not with enough force to tear the leaf,6,7,rinse off the carborundum excess sap from the leaf with water to remove compounds that could interfere with the inf
40、ection process,8,The indicator plants are placed in the greenhouse and checked daily for symptoms.If characteristic symptoms appear,we know that virus particles were present,光镜与电镜观察,光镜用于植物病毒内涵体的细胞学研究内涵体类型、形态、组成、亚结构及其位置等电镜(生物样品的分辨率35nm,0.10.2nm)观察病毒详细的结构、形态特征电镜负染技术:快速、简单和直接，但需要一定技能，而且工作比较集中，所以样本数量大则不
41、易处理。(磷钨酸及其钾或钠盐作负染剂）免疫吸附电镜技术（ISEM）：电镜与血清学技术结合：如胶体金免疫电镜技术成功用于检测病汁液中不同形态的病毒。,ISEM一般是把抗体先吸附在电镜铜网的支架膜上，加上抗原，然后再加第二次抗体，最后用醋酸铀作负染色。如抗原和抗体两者有反应，则第一次抗体可把抗原“捕获”于铜网上。第二次抗体的处理则使抗原粒子四周包被抗体分子，负染色的结果在抗原粒子四周形成一“抗体晕”。在电镜观察中，使抗原更为突出，易于观察。,光镜与电镜观察,免疫吸附电镜技术(ISEM)：特点：利用电镜高度放大率和分辨能力，直接对细胞内的抗原定位，看到抗原与抗体之间特异性反应和免疫复合物的形态学特征
42、，具有高度敏感性和特异性。当被测样本小时，它尤其适用。应用：广泛用于检测和鉴定植物病汁液中不同形态（线状、棒状和球状）的病毒。1973年发明以来，已成为植物病毒研究的一个重要手段，尤其是胶体金免疫电镜技术。,光镜与电镜观察,免疫电镜负染结果观察到大量圆形病毒颗粒，直径为2022nm,光镜与电镜观察,免疫吸附电镜技术(ISEM),A 金颗粒特异性地标记在病毒粒子囊膜表面的纤突上B 单抗与甲醛固定的病毒粒子发生特异性反应,Pinwheels,Scolls and Laminated Aggregates,Potyvirus Cylindrical Inclusions,Pinwheels,Scol
43、ls,and short Curved Laminated Aggregates,采用几种电镜技术观察病毒粒子的形态,Orf virus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎),Ebola virus埃博拉病毒（正染技术）,Vaccinia virus 痘苗病毒（投影技术）,负染技术,免疫学方法,在病毒检测中应用最广泛的有：ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)优点：具免疫荧光法和放射免疫法的反应灵敏、特异性强的优点、克服常规血清学方法中受病毒浓度、粒子形态和抗血清用量等缺陷。方法：间接法、双抗体法、双夹心法、竞争法应用：ELISA反应快速便利，适合于大规模田间样
44、本的常规病毒检测，也广泛用于脱毒植物、无性繁殖的苗木以及种子上的病毒检测。,酶联免疫吸附试验（ELISA）,间接法双抗体夹心法竞争法直接法双夹心法非标记抗体酶法,原 理：,酶标抗体,抗原,酶标抗原抗体复合物,底物,产物,显色剂,比色测定,酶促反应,将酶标记的抗原或抗体吸附到适当的载体上进行抗原抗体反应及酶催化反应。,免疫学方法,在病毒检测中应用最广泛的有：免疫扩散（单向与双向）用于比较同源、异源抗原，可区别病毒不同种和不同株系。斑点免疫结合测定法（DIBA）以硝酸纤维薄膜为载体进行酶联免疫吸附测定。硝酸纤维膜比酶联板便宜而且携带方便，进行田间病害诊断时，可直接用病毒粗汁液进行大量样本的测定。比
45、ELISA简单，实验流程短，不需任何特殊设备，而且灵敏度高。,抗原/抗体吸附在NC膜上，通过与相应的抗体/抗原和酶标记物反应形成酶标记的抗原-抗体复合物，加入相应底物后显色，呈现肉眼可见的颜色斑点，根据颜色有无和深浅判定。,免疫学方法,免疫扩散用于比较同源、异源抗原，可区别病毒不同种和不同株系,有共同抗原，但不完全相同,不同抗原,免疫学方法,在病毒检测中应用最广泛的有：组织印迹法在ELISA的基础上发展起来的植物病毒检测技术保持ELISA对病毒检测的灵敏度高、特异性强的特点，而且大大地简化了操作程序，对病毒的检测更加快速、简单、方便。印迹在硝酸纤维膜上的样品能保存3个月以上，检测结果能直观地显
46、示出病毒感染的部位。尤其适用于植物病毒的大规模普查，是近年来国外对植物病毒检测广泛采用的技术。,植物病毒的检测组织印迹法,1、基本原理与间接ELISA相同，首先将待测样品印迹在固相载体NC上，用病毒的家兔特异性抗体(Ig)与吸附在固相载体上的病毒进行特异性反应，再与碱式磷酸酶(Alkaline phosphatase AP)标记的第二抗体（羊抗兔Fc）进行反应，最后用碱式磷酸酶的反应底物BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium)进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。,植物病毒的检测组织印
47、迹法,具体反应：碱式磷酸酶（AP）以硝基酚磷酸盐为底物，在pH9.5条件下产生不溶性蓝色。(辣根过氧化物酶HRP是以H2O2为底物,需要供氢体如四甲基联苯胺(TMB)参与，在pH5.0条件下产生可溶性黄色产物，需借助比色分析.),植物病毒的检测组织印迹法,植物病毒的检测组织印迹法,基本步骤,1、采样,3、封闭,2、点样,4、洗涤,5、病毒与特异抗体反应,6、洗涤,7、第二抗体连接反应,8、洗涤,9、显色反应,10、终止显色,11、干燥保存,采取植物叶、茎根等，避免手与样品伤口接触，装入塑料袋。,将NC膜 置于平整洁净滤纸上，用手术刀片横切样品，将切口均匀压印在膜上，印迹清晰为宜，每张膜上可排列
48、数百个样品，设正负对照。,将点好样的膜置于盛有2脱脂奶粉的PBS封闭液的培养皿中，封闭液的用量以覆盖膜为宜在37下温浴 lh或 4 过夜,用PBS-Tbuffer洗膜3次，5min/次,将清洗后的膜转入含有特异性抗体的封闭液或PBS缓冲液的培养皿中，37下温育3h或4过夜,7 洗毕，将膜转入含碱式磷酸酶标记的羊抗兔第二抗体的PBS缓冲液中，37下温育3h或4过夜,9 将NC膜 转入显色液中直至阳性对照显色为止（510min）,10 待阳性对照显示清晰的紫蓝色时，将膜转入蒸馏水中终止反应,终止反应后将膜放置于干净的卫生纸之间，使之干燥，待完全干燥后过塑，便永久保存和观察,植物病毒的检测组织印迹法
49、的灵敏度,一次切割，连印45次（蕙兰花叶病毒）感病叶汁液稀释1：100 000，均呈+灵敏度可达20pg/ml(1pg=110-12g)较ELISA方法灵敏23个反应级,免疫学方法受到的限制,检测病毒的基础是利用病毒外壳蛋白的抗原性,但有些植物病毒在某些情况下缺乏外壳蛋白,而类病毒则没有外壳蛋白;季节性的不确定变化问题常阻碍+与-样品的区分:如ELISA可以检测出藜属的叶、花、果实中的CMLV,但对于休眠植物的木本部分却难以成功;病毒在感染植株上不均匀分布，病毒分离物的多样性也给ELISA法带来了问题，从苹果、樱桃、梨上分别取样检测ACLSV的存在，只有花瓣是可行的，因此准确鉴定局限于每个生长
50、期的2周时间;CMLV与PMV可以侵染相似的寄主，然而导致不同的病症,并且两者在血清学上相关，用ELISA不易检测。,病毒检测的分子生物学技术,灵敏度高、特异性强、检测速度更快、操作简便、可用于大量样品的检测。可以从植物体的任何部分取样检测,很容易区分病毒，甚至病毒的不同株系或分离物。应用组织印迹杂交技术检测蕙兰花叶病毒(CyMV)和齿瓣兰环斑病毒(ORSV),其灵敏度可达20pg/ml1pg(皮克)=110-12 g分子生物学检测法是通过检测病毒核酸来证实病毒的存在。此方法比血清学方法的灵敏度高,能检测到pg级甚至fg级1fg(飞克)=110-15g的病毒.,1、核酸序列分析技术2、dsRN
