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1、淋巴细胞的分离,人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。,外周血,红细胞,粒细胞,单个核细胞,血小板,淋巴细胞,单核细胞,1.093,1.0301.035,1.0751.090,Ficoll：1.0770.001,1.092,密 度,分 类,（PBMC）,密度梯度离心法,原理：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密
2、度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。为此利用一种密度介于1.0751.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。,（一）Ficoll分层液法,Ficoll为合成性蔗糖聚合物的商品名，无毒，但高浓度溶液往往不等渗，且粘性高，易使细胞聚集。组成：2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1份泛影葡胺生理盐水 Ficoll分层液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。分离人外周淋巴细胞以密度为1.0770.001的分层液最佳。别名：淋巴细胞分离液,实验方法,1.采
3、血，稀释（外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）,3.20，1500r/min，离心30min,1500rpm,20,30min,PBMC,红细胞、粒细胞,稀释的血浆、血小板,Ficoll,Ficoll,4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min，弃上清。6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。7.适量的培养基重悬细胞，计数。分离单个核细胞纯度为95%。淋巴细胞约占90%95%。,（二）Percoll分层液法,1、一种连续密度梯
4、度离心分离法。2、主要成分：硅胶颗粒，其大小不一，经高速离心后形成连续密度梯度。,PBMC悬液主要含淋巴细胞，但一般还混杂有数量不等的单核细胞及少量粒细胞、红细胞和血小板。那么怎样获得高纯度的淋巴细胞及其亚群呢？,淋巴细胞及其亚群的分离,(一)红细胞的去除一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。(二)血小板的去除将PBMC悬液通过离心洗涤23次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。,(三)单核细胞和粒细胞的去除,1粘附去除法 原理：单核细胞和粒细胞在37和Ca离子存在
5、条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。优点：简便易行，对细胞损伤极少。缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。,2羰基铁粉吞噬法 原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。,3苯丙氨酸甲酯去除法 原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透
6、压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。,（四）、淋巴细胞亚群的分离,原理：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。常用方法：（1）E花环分离法（2）尼龙纤维分离法（3）流式细胞术（4）磁珠分离术（5）亲和板结合分离法,(1)E花环分离法,原理：人类T细胞表面上有能与绵羊红细胞相结合的受体（E受体，CD2）,能与经溴化二氨基异硫基异硫脲氰化物（AET）处理的绵羊红细胞结合，形成稳定的、细胞体积和比重较大
7、的E花环。方法：淋巴细胞+SRBC悬液加入分层液T细胞形成E花环而沉于管底悬液中为B细胞。,E花环,（2）尼龙纤维分离法,原理：B细胞在37时易粘附于尼龙棉（聚酰胺）纤维上，而T细胞不具此能力。方法：淋巴细胞通过聚酰胺纤维管洗脱下来的是T细胞。,（3）流式细胞术,又叫荧光激活细胞分离仪(nuorescence activated cell sorter,FACS)法原理：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴(4000个/s)，每小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由
8、光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。,激发系统,细胞分选系统,荧光激活细胞分离仪分离法,检测与讯号处理系统,细胞流动系统及气压流速控制系统,流式细胞分析仪,（4）磁珠分离术,磁珠分离术是将磁性材料颗粒表面进行外理，微球的核心为小金属颗粒，核心处包裹高分子材料（聚苯乙烯），可结合不同的生物大分子物质（抗原、抗体、核酸等），若微球表面包被有免疫物质则称为免疫磁珠，其兼有免疫配基的性质和磁响应性质，即在磁场中显示磁性，移出磁场时磁性消除。目前商品出售的磁珠有直径为15um等不同的规格，表面活性基团有氨基（NH2）、羧基（COOH）和羟基（OH）等。包被的免疫物质有：一抗、
9、二抗等。,方法：将包被有关抗体的磁珠与待分离细胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应的细胞结合成：细胞抗体磁珠复合物，该细胞在磁场中运动与其他细胞产生明显差别。如采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结合的细胞将先被洗脱下出来。再将该柱移出磁场，与磁珠结合的细胞也将被洗脱下来，达到分离目的。,直接法对细胞进行分类,间接法对T细胞进行分离,免疫磁珠法细胞分选过程,免疫磁珠细胞分选装置,（5）亲和板结合分离法,原理：各种淋巴细胞亚群具有不同的抗性。分离CD4+或CD8+细胞，可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。分离B细胞用抗Ig抗体。分离有C3受体的细胞用活
10、化的C3包被。,将相应抗体结合于塑料平板上,抗原阳性的细胞与相应抗体结合,淋巴细胞的保存和活力测定,1、分离细胞的保存（1）短期保存用含有1020%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI 1640培养液可保存数周。,（2）长期保存及复苏,保存：在保护剂二甲基亚砜中于液氮（-196)中保存。其过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含有10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬 液，分装于冻存管内，立即放入降温过渡站(-80)中，继而进行降温(-196)冷冻。复苏：将其从液氮中取出，立即放入40 温水中，融化后加入10倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护剂，再悬
11、于新培养液中，计数并检查细胞活力。,2、细胞活力的检测,常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞而使细胞着色（蓝色）。,淋巴细胞的培养,正常情况下，人外周血中是没有分裂相细胞的，只有在异常情况下才能发现。外周血淋巴细胞一般情况下处于增殖期中的G1期，未经培养的外周血中很难找到正在分裂的淋巴细胞。植物血细胞凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，能使处于G1期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有PHA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的
12、生长活跃的细胞群体，加之，淋巴细胞遍及全身，并在所有器官组织中不断循环，能反映个体整体水平情况而不象体细胞那样具有局限性。,培养条件,1、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件，也是实验成功与否的先决条件。收获细胞前的所有步骤都要保持高度的无菌，严防细菌和病毒的污染。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。,2、恒定的温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36505，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。如果温度高于37，细胞的生长速度减慢；如果温度高于
13、40，细胞受损，超过43，则导致细胞死亡。培养箱的温度应严格控制在370.5，为了能精确有效的控温，在普通的隔水式恒温培养箱上可加装一个电子控温仪。若温度过高或过低，则会延缓分裂周期，造成收获时细胞分裂相减少。,3、气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有02和C02。C02既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，他在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.27.4，培养基的pH值也应调整到7.27.4之间，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。偏酸时细胞发育不良，偏碱时细胞会出现轻度固缩。细胞培养液pI-I的调节最常用的为加NaHCO，的
14、方法，因为NaHCO3，可供C02，但C02易于逸出，故最适用于封闭培养。,4、培养液RPMI1640培养基、培养用无机盐、胎牛血清(FCS)、HEPES、肝素、淋巴细胞分离液、植物凝集素(PHA)和白细胞介素等。植物凝集素(PHA)是体外淋巴细胞培养成败的关键，只有在PHA的作用下才能进入有丝分裂，因此要考虑它的质量和尝试，质量有问题药效会降低，浓度过高可能会导致红细胞凝集，都会造成实验效果差。,操作步骤,1、洗涤将收集到的淋巴细胞集中于离心管中用培养液洗涤两次，分别以2500和2000rpm离心各10min，弃上清，之后进行接种。2、细胞接种细胞接种通常是在无菌室超净工作台内的酒精灯火焰区
15、进行。接种时无菌操作是否规范，直接影响到细胞培养的成败。如接种时如不慎将手接触到培养瓶的瓶塞，或接触了注射器的针头，可能会造成细菌中霉菌的污染。接种操作是在酒精灯附近进行，接种时还应注意避免高温破坏。操作时手与酒精灯的距离以火焰不烫手为宜，离火焰太近，细胞可能被破坏，甚至被烧焦成块，肉眼可见呈团块；同时也会造成针头堵塞。出现这种情况，应及时更换针头。如已接种，应更换一瓶培养液。,3、摇床培养将接种后的培养瓶放于CO2培养箱中培养，条件为37、5%CO2、饱和湿度。从72h开始每48h添加等体积的新鲜培养液。,注意事项,一、严格无菌操作对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,
16、均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作。无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。二、血清的选择淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。血清浓度在5%20%时细胞生长比较好,当超过30%时反而不利于细胞生长。,三、pH 值细胞生长的最适pH 为7.07.2,可忍耐的pH 范围为6.67.8,当pH低于6.8 或大于7.6 时,都会抑制细胞生长。RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般升高0.20.4,故配1640 培养液及其
17、他用液时使pH 值达到7.2比较合适,并且需经常检测pH值。四、培养空间培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以110 为宜,培养液液面高度最好维持在25mm 的范围,以便于气体交换。五、恒温培养箱温度应维持在37,CO2 浓度为5%,O2 为95%,100%的饱和湿度。,常见失败原因,1.污染污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响较小,尤其只培养72小时。一般是分离过程中的用液和培养基出现了污染2.pH 值过高或过低,或培养过程中瓶塞不紧,CO2 逸出,导致pH 值上升。3.诱导剂 淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养
18、过程中须添加刀豆球蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)、白细胞介素2(IL-2)、植物血凝素(PHA)、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。须注意它们的浓度及是否失效。4.培养器皿洗涤不干净 有蜡、油污或酸残留,5.培养用液含有杂质配制过程中所使用的各种溶液必须用三蒸水,若含有Fe、Ca 等离子及杂质,可影响细胞的增殖。6.接种的细胞数目过多或过少,或提取的淋巴细胞中混有大量红细胞。7.血清质量不佳。8.恒温培养箱的CO2、温度等不稳定。9.存在个体差异在相同条件下,某一受试者的血培养不成功,而对照实验培养结果正常,其原因有时无法查出.淋巴细胞的生长情况,还与受试对象的年龄有关,青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。,人体外周血淋巴细胞培养技术是自20世纪60年代初发展起来的一种细胞培养技术，通过此技术在细胞遗传学方面的应用，可以用作诊断许多由染色体异常而导致的遗传性疾病，直至目前仍然作为基层临床诊断染色体疾病的主要手段之一。利用体外培养的淋巴细胞还可进行抗癌研究、爱滋病治疗、新药研制。,谢谢大家,
