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1、血液分析仪操作规范（讨论稿）,四川省医学会检验专业委员会,血液分析仪在我省已广为普及，它大胆提高了检验效率。如果能正确使用，会显著提高检验质量。但仪器种类繁多，测定原理各异，在病理情况下，不同仪器对异常标本测定的正确性会产生不同影响。有部分检验人员对如何正确应用仪器认识不足，致使结果准确性受到影响。为了提高检验质量，特提出以下意见供各实验室参考。,一、标本采集,血液标本尽可能用静脉血，少数不易取静脉血者如婴儿、大面积烧伤患者等可采用末稍血，末稍血以指尖血为宜，尽量不用耳垂血。采血前被检查者应处于平静状态，剧烈运动后应静息30分钟后采血。抗凝剂：使用K2EDTA，含量为1.52.2mg/ml容器
2、：采用密封式的塑料或经硅化的玻璃容器 采血过程压脉带不要太紧，束臂时间不超过2分钟，采血过程顺利，采血后先拔除针头,然后将血液徐徐注入试管中，轻轻颠倒混匀，避免产生泡沫。采血后放置15分钟测定，放置24小时内PLT、WBC、Hb、HCT、RBC保持稳定。,二、标本测定,应严格按仪器说明书操作,三、血液分析仪安装条件,1.机房要求：室内要有一定空间，尽量减少灰尘，室温维持在15-25。C。2.电源：要有稳定恒压的电源，最好配备UPS稳压电源，仪器一定要有地线，如果电源插座无地线，可在机壳上另接地线，地线一般可用2.5mm铜芯线接上一块易导电金属深埋于地下。3.仪器应放在稳定的工作台上，最好用水泥
3、台，避免震动。,四、血液分析仪的评价,购买血液分析仪前应参阅有关血液分析仪评价的资料和咨询已用过血液分析仪的用户，并仔细阅读厂家提供的资料。根据这些资料选择适合本单位的仪器。购置仪器后改换重要部件或重大维修后，均需对其技术性能进行测试评价。ICSH公布了对血液分析仪的评价方案，但未公布统一的指标要求，应根据各仪器厂家的有关说明书核对，鉴定是否已达到仪器的出厂要求。,精 密 度,精密度包括批内及批间精密度，选择红细胞低值、正常值及高值标本各10份，按常规方法分别测定红细胞数。每份标本重复测定3次，记录结果，将标本放室温2小时，再将每份标本测定3次，可得到不同浓度下的精密度。现以低值红细胞结果为例
4、（见表1），介绍统计学处理方法（单位1012/L）。,表1 低值红细胞测定结果,全部总和=82.23+83.37=165.6均值=165.660=2.76假设标本数为u，批数为v，重复次数为n，则平方和（Sum of Squares以下称SSQ）为：重复试验SSQ=（各测定值）2（小计）2/n=（3.1623.202+2.8522.742）（9.51210.322+6.3828.482）3=0.5411批间SSQ=（纵行之和）2/un（全部总和）2/uvn=（82.23283.372）/103（165.62/1023）=457.0776457.056=0.0216,均方（The mean sq
5、uare 以下称MSQ）为重复试验的 MSQ=重复试验SSQ/uv(n1)=0.5541/102(31)=0.0136批间MSQ=批间SSQ/（V1）=0.0216/(21)=0.0216,应该注意的是高值、正常值、低值标本必须分开进行测定，避免携带污染。白细胞及Hb的精密度可使用同样的方法进行检测。,携带污染率,为避免测高值标本后再测定低值标本时所产生的影响，在做携带污染率试验前，先测一定数量标本，使测定数值达到稳定，然后取一份高值标本，连续测定3次（i1、i2、i3），随后立即取一份低值标本连续测定3次（j1、j2、j3）。携带污染率以下述公式计算：携带污染率=100%,（i3j3）（j1
6、j3）,例如3次测得高值红细胞结果为7.237.227.30(1012/L)，低值红细胞结果为 0.64、0.57、0.52(1012/L)，携带污染率=100%=1.77%，按此法测定红细胞、血红蛋白、白细胞携带污染率各5份。,（7.300.52）（0.640.52）,如果没有极高值和极低值的红细胞标本，可以在预稀释模式以10ml稀释液加30ul正常血液做为高值标本，10ml稀释液加4ul正常血液做低值标本进行测定。白细胞及Hb的携带污染率可使用同样的方法进行检测。,总重复性,包含重复测定的随机误差与携带污染双重变异因素，测定时随机取标本20份（以白细胞测定为例），按常规方法测定白细胞，并放
7、置2小时及4小时后，再分别测定白细胞，将3次测定结果以变异分析法做统计处理。举例计算如下（见表2）。全部总和=31.960.347.510.4=520.2均值=520.260=8.67,设标本数为u，重复次数为n，则重复试验SSQ=（各个测定值）2（小计）2/n=7093.08(21258.36/3)=6.96,表2 白细胞测定结果,线性范围,一种测定方法，其测定值与稀释倍数成线性关系的范围越广越好，至少应包括正常范围及常见到的病理范围。测定方法如下：取抗凝血1份，3000转/分，离心30分钟，将血浆与血球分开，吸血浆0.3ml，加盐水150ml，此为稀释血浆；吸压积血球0.3ml，加盐水至1
8、50ml，此为100%血液（相当于压积血细胞稀释500倍），然后按表3进行混合。,表3 血液混合方法,稀释混合后各吸出0.1ml，加盐水9.9ml，即可进行红细胞计数线性测定，将剩余的血细胞悬液加溶血剂，进行血红蛋白线性测定，每个浓度测定三次。现将血红蛋白线性测定结果及统计处理介绍如下（见表4）。设血液浓度为自变量（X），为了简化将10%、20%100%分别以1、210代表，血红蛋白测定值为因变量（Y），总的测定N，则：N=30 X=165 X2=1155 Y=495.2 X2=10239.42,XY=3438.1直线函数Y=abX可诱导如下：一项=XY（XY/N）=714.5二项=X2（X
9、X/N）=247.5三项=Y2（Y Y/N）=2065.3b=一项/二项=714.5/247.5=2.88a=(Y/N)(bX/N)=（495.2/30）(2.88165/30)=0.666为了评价在某一浓度是否为线性关系，需将从回归线上的偏离变异值与重复试验变异值进行比较。重复试验变异值的求法，只是把每个稀释度当做一个标本处理。,表4 不同血液浓度Hb测定结果,重复试验SSQ=（各个测定值）2（小计）2/n=0.20667自由度（DF）=u(n-1)=10(3-1)=20变异值=SSQ/DF=0.0103此处u为不同稀释度标本的数目，n为重复测定的次数。然后计算每个稀释度（此外为100%浓度
10、），从回归线偏离的SSQ=三项重复试验的SSQ（一项）2/二项=2065.30.2066(714.52/247.5)=2.4257DF=u2=8变异值=SSQ/DF=2.4257/8=0.303变异比值=F=0.303/0.0103=29.4其自由度为8及20,查F值表n1=8，n2=20，P(0.01)处F值为3.63，此例中F=29.43.63故P0.05，故可判定该仪器血红蛋白测定的线性范围可从3g/dl到21g/dl。为了简化计算手续，可用血红蛋白测定值为纵坐标，血液浓度为横坐标作图。从接近回归线的点开始计算，远离回归线的点可以不去计算。现介绍如下，测试结果如表5。,表5 Hb测定结果
11、,将所得结果以细胞浓度为横坐标，测得Hb值为纵坐标，绘图（见下图）可初步看出70%以前成线性，其后各点已下垂。以10%至70%的各数据进行直线回归分析：a=0.071 b=0.281 r=0.999Y=abX以此公式计算各浓度应得值，与实测值进行比较，求出其差值（见表6）。,表6 预期值与实测值比较,从80%开始与预期值相差0.2g/dl，故此测定的线性范围在2.9/dl至19.8g/dl。,可 比 性,可比性是指一些血液学测定（如红、白细胞测定）尚无参考方法，因此要评价新仪器只能将所测结果与常规方法所测结果相比较，如一致即为与该常规方法有可比性，现以测定10例白细胞对比结果为例（见表7）。,
12、表7 仪器测定与常规测定白细胞结果统计表,假设被评价仪器测定结果为P，常规测定结果为Q，二者之差d=PQ，计算如下：n=10 d=0.5 d2=1.11d=0.5/10=0.05Sd2=d2（dd/n）/（n-1）=1.11(0.50.5)/10/(101)=0.12Sd=0.34t=d n/Sd=0.05 10/0.34=0.46自由度=n1=101=9查t值表，P0.05证明被评价的仪器与常规方法有可比性。,d,n,准 确 性,准确性指测定结果与真值的一致性，真值必须用决定性方法或参考方法才能测得。血红蛋白可用ICSH推荐的HiCN分光光度法作比较，测定100份随机选择的标本，将其结果与H
13、iCN分光光度法测定结果进行比较，然后用配对t检验进行统计分析。具体方法和可比性相同，只不过用来比较的方法为参考方法或决定性方法。,五、血液分析仪校准,血液分析仪具有快速、精密度高等优点，但由于生产仪器厂家多，测定原理各异，要保证测定结果的准确性，还必须对仪器进行校准。购置仪器后，在仪器使用前应对其进行校准。在使用过程中应每年定期校准一次，如果仪器更换之后 或经大型维修后应对仪器校准。,血液分析仪的校准可用商品的全血校准物，也可根据ICSH推荐的方法定值新鲜全血，应用定值新鲜全血进行血液分析仪的校准。由于用ICSH推荐的方法定值新鲜全血，难度较大，一般医院条件难以达到要求，建议用仪器配套的商品
14、全血校准物，同时应用仪器配套试剂，校准方法如下：应用商品全血校准物校准仪器,现在多参数的大型全自动血液分析仪在国内引进日益增多，一般可随仪器一起订购校准物，商品校准物均经过参考方法定值，新型大型血液分析仪虽精密度很好，但均为比较器，只有经正确核准，所得结果才准确，否则可产生一系列系统误差，而且进口的校准物试剂盒均有说明适用于哪些仪器及试剂，如用于不同仪器必须谨慎从事。,51仪器的校准方法 有了定值正确的校准物，在校准过程中必须操作正规，才能保证不会超过仪器校准误差的允许限度，现以库尔特S-CAL试剂盒为例，说明校准的步骤及注意事项。（自己配制的校准物可按此校准步骤操作）,511仪器的准备：使用
15、前仪器内部各通道及测试室均经清洗剂处理30分钟。校准前应检测仪器的空白计数，重复性（1份标本连续测定10次），携带污染及质控物回收试验合格，才可进行校准，否则需请维修人员进行检修。,512校准物准备：首先检查是否超过有效期，其次检查内容物是否变质或污染。将校准物从冰箱内取出后，置室温放置15分钟，使内含物恢复至室温。轻轻将校准物反复颠倒混匀，并放在两手掌间慢慢搓动，使内容物完全混匀。打开瓶塞时，应垫上纱布或软纸，使溅出的血液被吸收。将两瓶校准物合在一起，混匀，再分装于2个瓶内。,513校准物的测定：测定校准物前，先测定两份正常的新鲜血。取分开的校准物一瓶，连续测定11次，第一份结果弃去，以防止
16、携带污染。如无自动校准功能，则将211次各项结果填写在校准工作单上，并计算出均值，均值应比日常报告时保留的小数点后位数再多一位。,514核对标准：精密度校准：检查趋向性（结果是否持续上升或下降）以及是否达到使用说明书上所提供的精密度。如果不符合要求，停止校准，与维修人员联系进行仪器检修。校准的标准：如仪器无自动校准功能，计算各项参数均值与定值之间相差的绝对值，并与校准标准表比较（见表8）。如仪器有自动校准功能，仪器可自动计算出各项参数均值，与校准物标准表上的数值比较。计算出相差的百分数，不计正负号。核对结果等于或小于第一列数值，则不需再校准，如全部均小于或等于第一列数值，仪器不需进一步校准，将
17、各数值记录于仪器的记录本上即可。,核对后差异大于第二列数值，停止校准，与维修人员联系进行仪器检修。核对差异在第一列与第二列数值之间，需进一步校准仪器的因数，如有自动校准功能，可按说明书自动校准，如无自动校准功能，则将定值除以所测均值，求出校准系数，将仪器原来的因数乘以校准正系数，所得值即为校正后的因数，将仪器某项参数的原来的因数换成校正后的因数，输入仪器即校正完毕。,表8 校准标准表,(5)检验校准结果：将第二管未用的校准物轻轻混匀。将混匀后的校准物在仪器上重复测定11次，第一次结果弃去，求211次标本结果的均值，再与表8数值对照。如各参数全部等于或小于第一列数值，证明校准合格，仪器可以使用。
18、如不能达到此要求需与维修人员联系，进行检修。,六、室内质量控制,6.1 质控物的准备6.2 靶值和标准差的设立 在3-4天内每天分析每水平质控物3-4瓶,每瓶重复测2-3次,收集数据计算平均值、标准差，如有1个数据超过3S，删除该数据；如有2个数据超过3S应弃去所有数据，检查原因后重新按上述方法测定，计算平均值和标准差，以此平均值作为暂定靶值，1个月结束后，将该月的质控结果与前20个数据汇集在一起计算累计平均值和标准差，以此值做下一个月质控图，重复上述过程连续3个月，以此累计平均值作为靶值，对个别有效期内浓度水平不断变化的项目则需不断调整靶值。,6.3 控制限的设立控制限通常以标准差表示，标准
19、差不应大于美CLIA88能力对比检验，分析质量要求的可接受范围的1/4 即HB S靶值0.071/4 RBC S靶值0.061/4 PCV S靶值0.071/4 WBC S靶值0.151/4 PLT S靶值0.251/4 但应注意S太小易造成假失控，S过大易造成检出失控的敏感性降低。6.4 根据所确立的靶值和标准差绘制质控图,血液分析仪起过筛作用,两种观点：完全信赖仪器，一律不复检；任 何标本都须人工复检。两种观点都有失偏颇异常标本可出现下列图示,建议血液分析仪作为过筛，以下情况需手工方法复查。71、血红蛋白：凡WBC大于50109/L的标本需用HICN法，标本离心后比色测定Hb。72、RBC
20、：WBC Histogram低鉴别位准不出现，RBC Histogram基线过宽，MCV大于120fl同时RDW明显增高者应37放置30分钟后用仪器复查，如图1。73、WBC：WBC计数：WBC Histogram低鉴别校准不出现，应显微镜法复查，如图1、2、3。,74、WBC分类，因仪器不同各实验室可根据本实验室仪器特点制订合适的复查标准，以下几条仅供参考。741临床医生要求镜检742血液科初检的病人743直方图出现明显异常，如图4744急慢性失血、慢性肾功衰或其它已知非血液病原因的除外，凡有一系细胞数 明显异常者。745分类指标或直方图出现报警信号者746三分群血液分析仪中间细胞15%显微镜观察内容，各种细胞形态，分布、估计数量与计数的一致性，有无寄生虫，可根据仪器检查结果及病人临床特点确定镜检内容。,75、血小板计数：根据所用仪器计数原理不同，异常标本计数PLT差异较大,如图5、6-1、6-2、6-3复检标准有异。用免疫荧光法：二维激光法可直接报告，不需显微镜法复检。对于其它原理仪器复检标准以下几条可仅参考。751PLT60109/L752MCV65fl,753如MCV大于65fl RDW明显增大，且直方图30fl左右明显离开横坐标。如图754PLT计数有报警信号以上复检原则供参考，各实验室可根据本室仪器情况进行修改。,谢谢！,
