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1、2023/4/30,内容简介：祖细胞可通过多种效应起到对受损心脏的修复作用，是现流行的一种治疗心脏疾病的有效方法。其作用机制涉及自噬过程，本文对自噬发生过程涉及的各个环节做了详细的说明，以及总结了目前研究自噬的方法。,1.骨髓间充质干细胞（BMSCs）在治疗心脏疾病中的作用,3,祖细胞治疗心脏病变,2.自噬与心脏的关系,5,CM：cardiomyocytes,心脏疾病病变,凋亡,自噬,6,自噬（autophagy）是继凋亡后，当前生命科学最热的研究领域。比利时科学家Christian de Duve在上世纪50年代通过电镜观察到自噬（autophagosome）结构，并且在 1963 年溶酶体
2、国际会议上首先提出了“自噬”这种说法。Christian de Duve被公认为自噬研究的鼻祖，他也因发现溶酶体，于1974年获得诺贝尔奖。,自噬背景,7,自噬基因（autophagy-related gene，ATG）的克隆始于酵母（yeast）。第一个酵母自噬基因（ATG）于1997年被日本科学家Yoshinori Ohsumi小组克隆，命名为Atg1。第一个哺乳动物自噬基因于1998年被美国科学家Beth Levine小组克隆，命名为Beclin 1。截止到2010年9月已经克隆34个ATG基因。,背景,8,目前自噬最前沿的三个领域：1）自噬体膜的来源问题2）细胞器自噬，特别是线粒体自噬
3、（mitophagy）3）Beclin 1复合物的形成和调控蛋白以及mTOR信号通路在自噬中的作用,背景,9,自噬过程,10,class III phosphatidylinositol 3-kinase/Vps34 and Beclin 1(Atg6)complex,isolated memberance,recruiting Atg proteins,two ubiquitin-like protein conjugation pathways,Atg12-Atg5,Atg8/LC3-PE,Atg 16L,Atg12-Atg5-Atg16L,Atg5-dependent,localizat
4、ion,elongation,autophagosome,Atg调控机制,11,Atg12首先由E1样酶Atg7活化，之后转运至E2样酶Atg10，最后与Atg5结合，形成自噬体前体（Autophagosomal precursor）。,12,哺乳动物LC3前体合成之后，在Atg4同源物的催化下，形成可溶性形式LC3称为LC3-I，定位于胞浆中。之后，LC3-I在哺乳动物E1泛素样酶Atg7和E2泛素样酶Atg3的催化下，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）结合，称为LC3-II。,13,Atg12-结合和LC3-修饰两条泛素样修饰过程相互偶联。Atg10和Atg3两种E2样酶在调控autop
5、hagy上述两条泛素样修饰过程中发挥重要作用。Atg5是自噬的限速调控步骤，其过表达可增强自噬。Atg12泛素样结合位点赖氨酸130的突变可显著降低Atg5功能。LC3-II的形成依赖于Atg12-Atg5复合物：在Atg5-/-的胚胎干细胞或表达结合缺陷型Atg5基因（Atg5K130R）突变株的胚胎干细胞中，LC3-II是检测不到的。,14,Autophage in heart,no stress,basal levels,mild stress,enhanced,severe stress,excessive/long-term upregulated,autophage,1.maint
6、aining cellular homeostasis2.against excess or dysfunctional organelles,1.remodeling damaged/harmful organelles,2.recycling macromolecules,maintain energy levels,protein synthesis,1.excessive self-digestion of essential organelles and proteins,survival,death,heart fate,action,normal,3.自噬过程的信号调控,16,1
7、.mTOR（Mammalian Target of Rapamycin）信号途径 TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器，对细胞生长具有重要调节作用，抑制自噬的发生，是自噬的负调控分子，并发挥“门卫（gatekeeper）”作用。哺乳动物细胞中的核糖体蛋白质S6(p70S6)抑制自噬的发生，它位于TOR信号途径下游，活性受mTOR调节。Rapamycin通过抑制mTOR的活性，发挥抑制p70S6活性，诱导自噬发生的作用。,17,2.ClassPI3K/PKB途径 ClassPI3K是自噬的负调节分子，它可磷酸化PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2，生成PtdIns(3,4)P2和Pt
8、dIns(3,4,5)P3，然后结合Akt/PKB和它的活化分子PDK1,抑制自噬的发生。结节性硬化复合物1(TSC1)和TSC2蛋白位于型PI3K/PKB途径的下游，可通过抑制小G蛋白Rheb，抑制TOR激酶的活性，对自噬发挥正向调节作用。PTEN磷酸酶也是自噬的正向调节分子，它使PtdIns(3,4,5)P3 去磷酸化，从而解除型PI3K/PKB途径对自噬的抑制。,18,3.Gi3蛋白和氨基酸 GTP结合的G蛋白亚基Gi3是自噬的抑制因子，而GDP结合的Gi3蛋白则是自噬的活化因子。GAIP作为RGS 家族成员之一，通过Gi3蛋白加速GTP的水解，促进自噬的发生。AGS3也能正向调控自噬效
9、应。氨基酸作为自噬过程蛋白降解物的终产物，可负性反馈调节自噬。外源性氨基酸的去除，可以阻断TOR信号途径，而自噬产生的内源性氨基酸可补足氨基酸缺陷，恢复TOR信号转导。,19,4.其他 激素在自噬的调控中也起重要作用。胰岛素可抑制自噬，而胰高血糖素则促进自噬。酪氨酸激酶受体、PKA、casein激酶、MAP激酶、calcium 也存在于自噬过程错综复杂的调控网络中，但其机制还不甚清楚。,20,Autophage Signaling,研究方法,22,1形态学方法 电子显微镜 迄今为止，电子显微镜是研究autophagy的唯一可信赖方法。通过电镜可对细胞的自噬活性进行定量，自噬泡占胞浆总面积或体积
10、的比例是目前通过电镜对细胞自噬活性进行定量的唯一方法。Monodansylcadaverine(MDC)染色 MDC是一种荧光染料，被用作自噬泡的示踪剂。可与GFP-LC3及溶酶体标记物共定位。,23,2Autophagy的特异标志物 GFP-LC3定位 LC3-I到LC3-II的转化 Beclin 1 的表达,24,3Autophagy特异性抑制剂 3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）3-MA是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断自噬泡与溶酶体的融合，被广泛用作Autophagy的抑制剂 Rapamycin（自噬促进剂）CompoundC（AMPK抑制剂）其他 渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002和巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)等,谢谢！,
