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1、课前预习与目的要求,【课前预习】1.油镜的特点及使用范围是什么？2.革兰氏染色的原理是什么？【目的要求】1.学习并掌握油镜的原理和使用方法；2.了解革兰氏染色原理；3.学习并掌握革兰氏染色的方法。,油镜提高分辨率基本原理,油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间是隔一层油质。如香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。光线通过不减低视野的照明度；主要能增加数值孔径，提高显微镜的放大效能。分辨率=/2NA=光波波长（物镜的数值孔径值）NA=nsin=镜口角的半数可知n（介质折射率）对提高显微镜的分辩力起着关键性的作用。,革兰氏染色基本原理,细胞壁的成分和结构不同而造成的。草酸铵结晶紫初染成蓝紫色，碘
2、液媒染形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力，两种细菌的脱色效果不同，蕃红复染。革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红）。,细胞壁结构图,实验用品,菌种：大肠杆菌24 h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物
3、，枯草芽孢杆菌12 h18 h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液等。仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻片夹子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。,方法步骤,A.初染B.水洗C.媒染D.水洗E.脱色F.水洗G.复染H.水洗I.吸干,获得本实验成功的关键,选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。,注意事项,涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。加热时使用载玻片夹子及试管夹，以免烫伤。颜色判断以分散开的细菌颜色为准。使用染料时注意避免沾到衣物上。使用乙醇脱色时勿靠近火焰。实验后洗手。,实验结果,分别绘制菌体形态图，并描述其特征。填表,思考题,现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性，如何确定你染色结果的正确性？为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？,生物学实验教学中心,
