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1、【案例】3患儿，半岁，女。以突然发病出现发热、水样腹泻和呕吐等症状于2012年11月5日急诊入院，询问病史患儿为早产1个月，人工喂养，体检轻微脱水症，蛋花样粪便，体温38。患儿起病急，出现发热、水样腹泻和呕吐等症状，发病时间为深秋，体检轻微脱水征，蛋花样粪便。【讨论题】你作为检验人员，如何进行采样并进行实验室检验确诊？,1.案 例 分 析,2.样品采集及前处理,3.实 验 室 检 测,4.预 期 结 果,案例分析,01,1、急性水样便腹泻，多为轮状病毒或产毒素性细菌感染。小儿尤其是2岁以内婴幼儿，发病在冬秋季节，以轮状病毒肠炎可能性大；发生在夏季以产肠毒性大肠杆菌（ETEC）肠炎可能性大。2、
2、根据患儿表现出的症状（发热、水样腹泻、呕吐、蛋花样粪便）以及患病时间（深秋季节），高度怀疑为患儿感染了轮状病毒（rotavirus）；3、但同时还应该考虑到一些常见细菌的感染，例如：致病性大肠杆菌（蛋花样粪便）、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。4、喂养不定时、不当或以淀粉食品为主食，或饮食脂肪过多以及断奶后突然改变事物品种，均能引起轻中度腹泻（消化不良）。气候突然变化，腹部受凉肠蠕动增加；天气过热，消化液分泌减少；由于口渴，乳脂过多，增加消化道负担，均易诱发腹泻。大便为稀薄或蛋花汤样，无脓血和酸臭味，如不及时控制，极易引发肠道感染。,案例分析,样本采集及前处理,02,4,3,2,1,取30g奶粉于
3、无菌采样袋中，密封,患儿血液：,患儿粪便：,奶瓶：,婴儿奶粉：,洁净棉拭子采样,采样杯采集婴儿新鲜粪便，0保存,普通真空采集管采集患儿足跟血；,5,6,接触物品：,接触人群的手：,洁净棉拭子采样,洁净棉拭子采样,实验室检测,03,Part 1,Part 2,Part 3,动态血常规检测CRP值检测,细菌学检验,病毒学检查,在临床上可以通过动态血常规检测、CRP值检测来对两种疾病新生儿进行初步鉴别。轮状病毒感染新生儿通常有发热及轻微消化道症状，易与严重细菌感染的新生儿混淆。从严重细菌感染新生儿的WBC、CRP检测结果来看，发病初始阶段（12h）的WBC、CRP水平与轮状病毒感染新生儿无无显著差异
4、，但发病24h后则显著高于轮状病毒新生儿。,轮状病毒：轮状病毒基因组由11个不连续的dsRNA节段组成，分别编码6个结构蛋白(VPIVP4，VP6和VP7)和5个非结构蛋白(NSP1一NSP5)。VP6是内层衣壳的主要成分，具有组和亚组抗原性，不同株轮状病毒VP6蛋白具有高度保守性。,检测方法的选择,01,real-time RT-PCR检测A组轮状病毒的灵敏度优于其他4 种方法,可用于轮状病毒的高通量检测;ELISA和胶体金具有良好的灵敏度与特异性,且胶体金成本低,非常适合于初筛检测。行业标准推荐的RT-PCR尽管特异性较高,但灵敏度偏低,有待改进，ELISA法诊断效能优于胶体金法，胶体金法
5、敏感、快速、单独样本可随时检测。综上本小组选用胶体金法作为初筛方法 real-time RT-PCR作为确诊方法,检测方法的选择,01,胶体金免疫层析法原理：以抗A组轮状病毒多克隆抗体包被硝酸纤维素膜、以胶体金标记的小鼠抗A组轮状病毒VP6单克隆抗体为结合物，利用免疫层析原理来检测粪便标本中的轮状病毒抗原。将试纸条插入用稀释液稀释好的标本中后，胶体金结合物与标本一起移动，当移动至硝酸纤维膜上的抗轮状病毒多抗时，如果标本中含有轮状病毒，则胶体金-轮状病毒结合物会与抗轮状病毒多抗结合，5-10分钟出现红色的检测线。多余胶体金结合物继续移动，将与包被在膜上的羊抗鼠IgG抗体结合，形成另外一条红色的对
6、照线。,胶体金免疫层析法原理,02,具体方法是提取适量的患者粪便放入到试管内，加入9倍的生理盐水后均匀搅拌，在静止后或者低速离心以后，在加样处另外滴加3-4滴粪便上清液，在室温情况下，10min以后进行辨别分析。如果测试卡显示的是两条红线，即可判断属于阳性，如果只仅仅出现一条对照线，则阴性，若没有出现对照线，说明检测结果无效，必须重新进行检测。,轮状病毒初筛,03,轮状病毒确诊,04,轮状病毒的确诊采用 real-time RT-PCR作为确诊方法。方法原理：，取待测样品，加入匀浆缓冲液研磨，通过温育促进病毒粒子释放，利用PEG8000使病毒沉降，采用纳米磁珠直接从PEG8000沉降后的病毒悬
7、液中富集病毒粒子，吸附于纳米磁珠上的病毒粒子经高温裂解，释放出病毒RNA，无需进一步纯化，直接实时荧光RT-PCR方法进行检测。,real-time RT-PCR检验流程图,荧光PCR结果的判定1、对照结果）阳性对照：有荧光增幅现象；）阴性对照：无荧光增幅现象；）空白对照：无荧光增幅现象；）否则，实验视为无效2、检测结果判定 A、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品无荧光增幅现象，则判断样品中未检出 群轮状病毒。B、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值 35时，则判断样品中检出 群轮状病毒。C、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧光RT-PCR 检测。若重新检测的Ct值40时，则判断样品中未检出A群轮状病毒。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，则判断样品中检出A群轮状病毒,04,预期结果：该患儿为轮状病毒感染确诊依据：1、细菌培养未见可疑菌生长2、WBC/CRP值未出现升高现象3、实时荧光PCR确诊结果阳性,预期结果,
