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1、在抗肿瘤研究中，人们提出了肿瘤多步骤、DNA突变、细胞凋亡、细胞周期核心机制、细胞周期启动及多条信号转导途径参与等许多理论和学说。抗肿瘤药的研究随着理论的更新和技术的进步，已从以核酸等为靶点的杀伤型细胞毒药转向对肿瘤新靶点的研究。包括化学预防药、分化诱导剂、凋亡诱导剂、信号传导阻滞剂、血管生成抑制剂、肿瘤耐药逆转剂、生物调节剂以及化放疗保护剂等。随着新型抗癌药的研究，诞生了许多抗肿瘤药物实验方法。,第1节 肿瘤细胞体外筛选方法,一、抗肿瘤药体外方法 动物模型在抗肿瘤药物的评价中起重要的作用，但动物模型费用高，周期长使其不适合大规模的抗肿瘤药物评价。因此抗肿瘤药初步筛选首先应采用肿瘤细胞体外实验
2、方法，既节约成本又节省时间。,1.MTT法【基本原理】活细胞线粒体中存在的脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）为蓝紫色的甲臜；而死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解甲臜后，570nm处酶标仪测定其吸光度（OD值）。OD值与活细胞数成正比，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。,【操作步骤】（1）0.25%胰酶消化对数生长期细胞，5%10%NBS的RPMI 1640调细胞浓度50000个/ml。96孔板100ul/孔。设溶剂对照，每组3-6平行孔。37，5%CO2、95%空气的培养箱中预培养24h，弃
3、上清。（2）加药物5个10倍稀释的浓度（溶剂常用的有二甲亚砜和水)，通常为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。（3）细胞连续培养2472h，每孔加入10l 5mg/ml的MTT溶液（以无血清培养基配制），继续培养4h。（4）吸去上清。加入200l DMSO，轻轻振荡以使甲臜完全溶解。570nm处用酶标仪测定OD值。（5）计算抑制率(%)=（对照OD-药物OD）/对照OD*100%,2.XTT法【基本原理】XTT 是MTT的衍生物，经过活细胞代谢还原成水溶性的代谢产物，代谢产物的量与活细胞的数目成正比，因此利用酶标仪在检测波长465nm处测定代谢物的OD值可以推测活细胞的
4、数量。数据处理方法同MTT法。,【操作步骤】（1）细胞接种，药物处理均同MTT方法。（2）药物处理2472h后，每孔加50l XTT溶液（内含50g XTT，5l 10mmol/L的电子偶联剂(PMS)）继续培养4h。（3）96孔培养板振荡23min后，直接用酶标仪在465nm波长处测OD值。,【注意事项】（1）优点：XTT代谢产物溶解于水，不需要吸去上清就可测OD值，简单方便，减少误差。（2）XTT不易被线粒体酶还原，因此同时加入电子偶联剂(PMS)。（3）每孔的XTT量不宜加入太多，高浓度的代谢产物抑制线粒体酶活性。（4）XTT和PMS现用现配。,3.染料排斥法检测药物对肿瘤细胞的生长抑制
5、【基本原理】活细胞有排斥染料（如伊红、台盼蓝、苯胺黑等染色的能力，而细胞死亡后由于膜完整性遭到破坏，细胞即被着色。,【操作步骤】（1）25ml培养瓶中加入细胞4104个、受试药40l，终体积4ml，（2）5%CO2，37培养4896h。（3）取细胞悬液0.4ml，加0.4%台盼蓝液0.1ml，在室温作用5min，在15min内，细胞计数板计数约200个细胞中死细胞（蓝色）的个数。【结果评定】（1）活细胞率%=（未染色细胞数/细胞总数）100%。（2）将活细胞率与药物浓度的对数作图，可得到S形剂量反应曲线，计算半数杀伤浓度（LC50）。（3）当LC5010g/ml并能重复时，提示药物应进一步实验
6、。,【注意事项】药物杀伤细胞作用可能被低估原因：（1）存活细胞可能继续繁殖，使活细胞率增高。（2）死细胞可能过早地崩解，计数时已不存在，使死细胞率下降。,4.集落形成法测定药物对肿瘤克隆原细胞的生长抑制作用【基本原理】克隆原细胞指具有持续增殖能力的细胞。当单个细胞能连续分裂6代或以上时，其后代所组成的群体（集落）含50个以上细胞。计数集落可以对克隆原细胞作定量分析。反映了单个细胞增殖潜力，能较灵敏地测定抗肿瘤药物的活性，目前被认为是一种较理想的检测方法。常用的集落形成方法可分为贴壁法及半固体培养基法。,【操作步骤】（1）贴壁集落形成：适用于几乎所有贴壁生长的细胞。1）生长期贴壁细胞一瓶，胰蛋白
7、酶消化成单细胞悬液，活细胞计数，培养基稀释成50100个细胞/ml。2）取直径3335mm培养皿（或15ml培养瓶）或6孔板，每组3复孔/皿，受试药20l，稀释后细胞悬液2ml，摇匀，5%CO2、37培养箱培养714天。3）弃上清，PBS洗2次，2ml/次，无水甲醇固定5min，静置干燥，用吉姆萨染色或1%结晶紫染色510min后，用自来水冲洗，室温干燥，镜下计数75m以上的集落。,（2）软琼脂集落形成：适用悬浮和贴壁生长细胞。1）计数对数生长期细胞，15%NBS培养液配成1000个/ml细胞悬液，37温育。2）取3335mm培养皿，3复皿，加受试药20l。3）取37新鲜培养液9份，加沸水浴中
8、融化的5%琼脂液1份，摇匀，加入平皿，每个1ml，混匀置室温使琼脂凝固。4）取预温的细胞悬液按每9.4ml加5%琼脂液0.6ml的比例混匀，加入已铺底层琼脂的平皿中，每个1ml，置室温使琼脂凝固。5）将平皿置5%CO2，37孵育箱中培养710天。6）镜下计数直径大于75m（50个细胞以上）的集落。,【结果评定】（1）剂量反应曲线：以集落抑制百分率与剂量对数作图，可以得到一条S形曲线并求出药物的半数抑制浓度（IC50）。（2）亦可计算各加药组集落形成率。,5、癌细胞分化诱导实验【基本原理】癌症属于细胞分化异常的疾病。恶性肿瘤存在着明显的细胞分化受阻。白血病、黑色素瘤、肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤等
9、可在体外被某些化合物诱导分化为正常细胞或近似正常的细胞。这些发现为抗肿瘤药物研究开辟了一条新的途径。因此，癌的分化治疗已成为癌症研究的重要前沿方向之一。,分化指标包括形态学变化、及生化功能变化。人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的分化诱导实验HL-60细胞分化为成熟度不同的粒细胞或巨噬细胞 硝基四氮唑蓝（NBT）试验:NBT还原能力应大于50。形态学变化的观察:成熟粒细胞所占比例越高，说明分化效果越好。吞噬功能测定:分化诱导剂的吞噬百分率应在50以上。,肝癌Bel 7402细胞分化诱导实验【基本原理】肝癌Bel 7402细胞甲胎蛋白（AFP）在肝癌中分泌量很高。-GT（半乳糖转移酶）在癌症发生发
10、展过程中活性逐渐上升。白蛋白（ALB）及TAT（酪氨酸转氨酶）在分化良好细胞下降。在体外测定这些蛋白的含量及活性，用以判断肝癌细胞的分化程度。AFP及ALB测定：AFP、ALB放免测定试剂盒说明测定AFP及ALB含量-GT、TAT测定：紫外可见分光光度法。,第2节 肿瘤动物模型体内筛选方法,1.诱发肿瘤动物模型实验法 2.自发肿瘤动物模型实验法3.移植性肿瘤动物模型实验法4.转基因动物肿瘤实验法,对诱发肿瘤的评价诱发性肿瘤的病因与由环境因素所诱致人癌情况相似。癌细胞增殖动力学在两者间亦接近，故动物诱发肿瘤类似人体肿瘤。但人癌原因十分复杂，诱癌剂不清，肿瘤的病理组织学与动物不同，发生发展与动物诱
11、发肿瘤不完全一致。诱发肿瘤不仅诱发需时较长，成癌率不高。多数内脏肿瘤不作解剖，难以判断是否已发生肿瘤。发生时间先后、发展速度个体差异大。加之化学致癌物的来源比较困难，并随着环境保护意识的增强对相关的动物实验室提出了更高的要求和限止，所以本法不宜作一般抗癌药物筛选应用.对移植性肿瘤有效的药物，可用本法进一步验证其抗癌疗效。,对自发肿瘤总的评价其肿瘤发生率与瘤细胞动力学特点与人癌近似，生长较移植肿瘤慢，对药物敏感度不高，疗程较长，故便于进行综合化疗的研究；理论上用带有自发肿瘤模型筛选药物较理想。然而，动物自发肿瘤的病因取决于的遗传特性，与人癌病因区别较大。很难在限定期间内得到大量生长均匀的带瘤动物
12、，各动物肿瘤之间生长速度差异也较大，给评价带来困难。此类肿瘤常用于特殊目的试验或作为“二级筛选”模型。,对转基因小鼠肿瘤模型的评价该模型较好地再现了人类肿瘤发生发展的完整变化，包括机体从正常演变为癌前病变进而发展为恶性肿瘤的全过程，该模型也为相关基因与肿瘤的关系在整体水平研究和基因药物的研发提供了良好的手段。但肿瘤的发生受到一个或多个基因的协同调控的，与转基因小鼠肿瘤模型不同；该模型同样存在实验周期长、肿瘤发生时间不齐、繁育能力较低以及成本较高等缺点。,移植性肿瘤实验法,动物移植性肿瘤实验法是最通用的抗肿瘤方法，比自发性、诱发性及转基因动物肿瘤容易造模,成功率高（100），且能同时获得大量生长
13、相对均匀肿瘤。一般给药7-10天，第8-11天解剖动物。观察指标：一般状况，体重变化及死亡率，判断药物是否有明显的抑制肿瘤生长的作用，为抗癌药物临床疗效提供有意义的依据。动物移植性肿瘤是任何体外试验不能代替的。,一种药物未必对各种类型的移植性肿瘤有效，选择某一瘤株供筛选都可能漏筛药物。动物肿瘤的生物学特点与人类有较大的差距，动物瘤株恶性程度高，生长迅速，对药物的敏感性比人类自发的癌瘤高得多，因此，对动物肿瘤生长有抑制的药物对人癌不一定有效。本法的命中率低。,筛选药物时最好采用三种瘤株，即肉瘤、腹水型肿瘤和白血病株肿瘤。国内用肉瘤S180、艾氏癌腹水型EAC和L615白血病，目前L615往往以P
14、388或L1210小鼠白血病株取代。我国对新药在第一轮筛选有效的基础上，推荐人癌异种模型进行第二轮筛选，即人癌进行T细胞免疫缺陷或免疫抑制裸鼠异种移植模型。,1.1动物选择 常用小鼠、大鼠和地鼠。每批实验用同一性别（但乳癌、卵巢癌、宫颈癌等必须用雌性）。1.2肿瘤移植(1)一般要求 无菌、低温（消毒不严、瘤块污染常是接种失败的主要原因）接种部位:皮下接种(右前肢腋);肌肉接种(大腿肌肉部);腹水型接种(腹腔)。,(2)瘤块制备：取接种7-10天、生长旺盛且无溃破瘤源。消毒，切开皮肤、瘤生长良好（无坏死或液化），放入无菌平皿，剪成2-3mm3小块。平皿应置于冰上。无菌套管针抽吸或向套管针内塞进一
15、小瘤块。一般应在30min内接种完毕。(3)瘤细胞悬液的制备：数个瘤块混合，剪成小块，用玻璃组织匀浆器研磨，生理盐水适量稀释成l：3或l：4的瘤细胞悬液。,(4)腹水型肿瘤悬液的制备 1)抽取腹水：选择接种后7-10天瘤源动物，腹水应为乳白色浓稠液体(如黄色或有大量红细胞则弃去)。2)细胞计数：用白细胞计数法计瘤细胞总数。3)接种：腹水用无菌生理盐水或含葡萄糖的平衡盐水(如Hanks液、Gey液等)稀释至适当的浓度（1107/ml），ip每鼠0.2ml。(5)白细胞瘤株的接种：腹水型白细胞瘤如P388及L1210的接种同腹水型肿瘤接种法。,1.3 移植性动物肿瘤的质量鉴定(1)每年进行一次实验
16、动物瘤株的组织学检查。(2)接种前置37培养箱内以检查细菌，霉菌;在接种和传代过程中，必须严格无菌操作，防止感染。(3)肿瘤生长潜力的检查 1)实体瘤：若对照组中20肿瘤400mg或平均重量1g；大鼠肿瘤平均重量小于2g，作废。2)腹水型肿瘤：对照组平均生存率应在规定范围内。,(4)死亡分析：动物体重减轻、明显的感染等都会影响实验的可靠性，必须追究原因（是否给药剂量过大等）。(5)阳性对照：通常选用对所选瘤株敏感的已知抗肿瘤药作阳性对照。如S180、EAC皮下型可用环磷酰胺2030mg(kgd)；L615可用5-Fu 25mg/(kgd)。在同类型化合物抗肿瘤试验时，最好使用同类型临床有效的药
17、物。,1.4 待筛药物的给药途径 化学合成药、抗生素滤液及植物药的提取物，通常用ip、sc或ig给药，其他途径有im、iv等。1.5剂量的选择一日量可用l/31/5 LD50 剂量参考同类药物临床剂量参考同类药物动物剂量预实验,开始有动物死亡计量的l/31/5为一日量,1.6动物分组随机小鼠体重相差不超过4g；每组小鼠平均体重相差不宜超过1g；每组大鼠平均体重相差不宜超过5g。,1.7疗效评价(1)实体瘤疗效评价在治疗期间给药组死亡超过20，或平均体重(去瘤后)下降(自身对照)超过15者，表示药物毒性反应，减少剂量重新试验。瘤重抑制率=(1-TC)100中草药抑制率大于30，合成药大于40，并
18、经统计学处理有显著差异时，认为有苗头，继续重复，连续3次，疗效稳定，则评定此药有一定疗效。,(2)腹水型肿瘤疗效评价：逐日记录动物死亡情况。对照组通常2-3周内死完。如对照组动物7天内死亡20；或20存活4周以上，实验作废。治疗组观察时间一般为30天或60天(生存超过此时限者，仍按30天或60天计算)。分别记录对照组和治疗组的平均生存时间，按下列公式计算生命延长率：生命延长率=(TC1)100非腹腔给药时生命延长率大于50，或腹腔给药生命延长率大于75，并经统计学处理有显著差异时，认为有苗头，需继续试验。连续3次，疗效稳定，则评定此药有一定疗效。,1.8瘤株的选择 目前临床上常用的抗肿瘤药大多
19、首先经动物移植性肿瘤筛选而发现的，从寻找新药角度看来，按照我国目前条件和情况，筛选细胞毒类药物时可选用肉瘤Sl80腹水型或实体型、艾氏癌腹水型(EAC)或实体型(ESC)、肝癌Hep腹水型(HAC)或实体型(H22)、Lewis肺癌LL、白血病L1210和P388、黑色素瘤B16、肉瘤S37、肠癌C38、C26及Walker癌肉瘤W256等。,从天然产物中寻找新抗肿瘤药物可选用S180实体型、ESC、LL、L1210和P388、B16、HepA或S、肠癌C26、C38、子宫颈癌U14、白血病L615以及W256等。企图用一种模型去筛选各种不同类型的新药，显然是不恰当的，因为各种动物移植瘤对抗癌
20、药物的敏感性不一样。,1.9肿瘤的低温保存冷冻保存液可以改变细胞或瘤块的渗透性，减少细胞内的水分，防止水分在细胞内产生大量冰晶，如含15的甘油或10二甲基亚砜的培养基。冻存时，慢冻（引起的细胞损伤最小），损伤是由于在极少量未结冰水中保留了高浓度电解质引起，因此细胞从0-20C间冷冻速度要缓慢，一般以每分钟降1C为宜。然后再将安瓿放置于干冰(固体CO2)或液氮中保存。一般可保存6个月左右。速融，冻存管迅速放入38-40度水浴，RPMI1640 液洗涤1-2次，接种。,1.10移植性肿瘤实验法举例l.l0.1小鼠腹水型L1210模型【基本原理】将小鼠白血病L1210瘤细胞悬液ip小鼠，给予不同剂量
21、抗癌活性药物，可延长荷瘤宿主的生命。【操作步骤】(1)无菌取DBA/2小鼠约7d的L1210腹水，生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为5106/ml，ip小鼠0.2 ml(L1210细胞105个)。每组6-10只动物。（雄性,l8-22g，雌性17-21g，每次实验均用同一性别），接种当天为d0。,(2)d1称重、随机分组，给药，包括阴性对照(溶剂)及阳性对照药，一般用腹腔注射(方案可有多种：仅给1次，次日给药；每日一次，连续7天；于第1、5天或第1、5、9天每隔4天给药一次等)。记录30天内各组动物的死亡情况，至第30天，统计各组动物的平均死亡率。【结果计算】根据公式计算试药对L1210的延长
22、生命率。(L1210平均存活期8-1ld。一般腹水型肿瘤的实验观察期为30d，未死亡动物以30d计)。,【方法评价】(1)本法也适用P388、EAC、HepA、w256及S180等腹水型移植性肿瘤模型。(2)给药组第5天动物存活数应大于65，否则表示药物剂量过大。(3)若阴性对照组动物在15d内仍不死亡，说明实验失败，应分析原因，重做。,1.10.2 实体瘤模型以肉瘤S180皮下接种【基本原理】皮下接种同种宿主前肢腋下S180，给予抗癌活性的药物，可以抑制肿瘤在体内的生长。【操作步骤】(1)无菌取接种于昆明小鼠约7天的S180腹水或S180肿瘤。S180肿瘤无菌剔除包膜和坏死部分，选取完好的瘤
23、块，置于玻璃匀浆器内，加入适量的生理盐水，计数，以生理盐水配制成悬液（1107ml），0.2ml/只接种于小鼠前肢腋下，10只一组（雄性体重l8-22g；雌性17-21g）。,(2)第2天（d1）称重、分组、给药。(3)第11天，动物称体重，取肿瘤，称重，最计算抑瘤率。【结果计算】按上式计算样本对S180的抑瘤率。【注意事项】(1)本法适用于Hep、w256及C26等实体型模型。(2)原则上,阳性对照组的肿瘤抑瘤率应80。阴性对照组肿瘤为2g左右。(3)试验组动物体重不低于原始体重的20，否则表示试药剂量过高，需降低剂量重试。,1.10.3肌肉接种大鼠Walker癌肉瘤W256模型【操作步骤】
24、(1)Wistar大鼠，55-65g。后腿肌内接种瘤细胞悬液0.2ml(约2-4106个瘤细胞),每组用6-10只动物.(2)接种分组给药同前。至第8-11天，处死动物，将双侧后肢从髓关节处剪下，分别称重，荷瘤肢重减去正常肢重即为瘤重。【结果计算】按荷瘤宿主瘤重抑制率公式计算。,注意事项(1)本法也适用于S180及EAC等肿瘤。(2)接种用瘤源有两种：一种取用腹水型瘤源，取传代6-8天的瘤源，抽出的腹水应带有血性；另一种取用皮下接种的肿瘤以匀浆法制成瘤细胞悬液。(3)对照组肌肉型平均瘤重为3-5g；皮下型平均瘤重为3-12g；腹水型平均生存l0-14天。(4)d7给药动物存活率65,否则剂量过
25、大。,1.10.4 足趾皮下接种小鼠Lewis肺癌模型【基本原理】恶性程度较高，受体鼠为C57BL/6，SC、IM接种对药物的敏感性较低，自发转移肺。接种于后足趾皮下后，待肿瘤生长10d，切除带瘤足趾称重，计算抑制率。【操作步骤】取皮下接种8-12d的肿瘤，制成1107/ml 悬液,足趾皮下接种5105/0.02ml，接种于C57BL/6,18-24g，6-7Wk。给药后，次日处死动物，将带瘤后足趾从足关节处剪下，分别称取荷瘤足趾重，与阴性对照组比较，计算抑瘤率。【结果计算】计算肿瘤抑制率.,【注意事项】(1)Lewis肺癌由于其接种的部位不同，可观察抑瘤率、生命延长率、自发肺转移。(2)Le
26、wis肺癌对环磷酰胺及亚硝脲敏感，对5-Fu及博来霉素的敏感性稍差。(3)Lewis肺癌的足趾接种具有两种意义：一是直接取荷瘤的足趾测算样本对原发灶的抑瘤率；继续给药又可观察样本对自发肺转移的效果。(4)本实验只适用于宿主为近交系的肿瘤模型，因接种的细胞量偏少，若应用于非近交系动物，肿瘤的生长将会出现较大的偏差，结果难以统计。,1.10.5 人体肿瘤异种移植于裸鼠的模型【基本原理】裸鼠又称无胸腺小鼠，具有先天性胸腺缺失；胸腺依赖性免疫功能缺乏，其T细胞功能接近于零，但B细胞功能基本正常，体内不具排斥反应，故是人体肿瘤异种移植的理想宿主。异种移植于裸鼠体内的人体肿瘤仍保持其原有的组织形态及生化功
27、能，以及特有的染色体组型和对抗肿瘤药原有的敏感性。一般认为人体肿瘤异种移植于裸鼠的模型对抗癌药的反应与临床有较好的相关性，对临床疗效有重要的参考价值。,【操作步骤】(1)人体肿瘤异种移植于裸鼠的瘤源：一是已建株的人体肿瘤异种移植于裸鼠的模型，腹水型或实体型，与移植性动物肿瘤模型一样进行操作。二是培养的各种病理类型人体肿瘤细胞。(2)经一定的潜伏期，可见肿瘤生长。待肿瘤增殖至可触及时(瘤结节约400mg)，将动物随机分组，进行治疗。亦可在肿瘤接种后次日即分组治疗。,【结果计算】(1)计算给药组肿瘤抑制率、生命延长率。其计算方法同移植性动物肿瘤模型。(2)裸鼠因皮肤无毛，可便于用卡尺从体外测量肿瘤
28、的体积，易于动态观察肿瘤的生长状态，比较治疗组和对照组肿瘤增殖曲线的变化。每次测量肿瘤的长径(L)和短径(W)根据下列公式计算肿瘤体积(V)：V=(Lw2)/2。,【注意事项】(1)裸鼠因T细胞免疫缺陷的特性，故对外界的环境非常敏感，因此裸鼠一定要饲养于无特殊病原体(SPF)的环境，至少需饲养于层流架内，其饲养笼需附带有滤膜的盖。所接触和使用的器具、饲料、饮水、垫料、笼具均预先用高压灭菌处理过。所用的试药也应无菌处理。实验操作也应在层流柜内进行。(2)价格比较昂贵，实验所需代价高。一般要在试药通过动物移植性肿瘤有效的基础上再进行本实验的试验。,(3)异种移植于裸鼠体内的人体肿瘤因仍保持其原有的
29、肿瘤特性，故其生长周期相对较动物肿瘤模型为长，因此，有关给药的方案，尤其是给药的时间和周期因瘤株而异。,1.10.6小鼠肾囊膜下肿瘤移植法 1.10.7抗转移模型的举例1.10.7.1 Lewis肺癌自发肺转移模型1.10.7.2 B16小鼠黑色素瘤人工肺转移模型1.10.7.3小鼠Hep肝癌脾内移植后肝转移模型1.10.8癌侵袭的动物模型1.10.8.1癌骨侵袭大鼠walker-256模型1.10.8.2肾侵袭小鼠宫颈癌U14模型1.10.9原位移植癌动物模型1.10.9.1小鼠胶质母细胞瘤G422脑原位瘤试验法 1.10.9.2大鼠肝癌BERH一2肝原位移植癌试验法1.10.9.3人胃癌S
30、GC一7901裸鼠原位接种模型，1.10.10 W256肝内接种介入治疗的模型1.10.11癌分化诱导的动物模型等。,四、转基因动物肿瘤模型转基因动物肿瘤模型（Tumor models of transgenic animal）是指通过重组DNA技术将外源肿瘤基因或相关基因导入动物染色体基因组，使之稳定表达并能遗传给后代的一类肿瘤动物模型。转基因方法主要有显微注射法、精子载体法、电转移、胚胎干细胞移植法、反转录病毒感染法、人工酵母染色法等多种方法。用转基因技术构建的肿瘤模型可为肿瘤研究提供理想的动物模型，为深入研究其发病机制以及基因药物的等创造了前所未有的条件，为人类精确地研究基因与疾病的相关
31、关系提供了可能。但转基因动物肿瘤模型也存在一定的稳定性，长期繁育传代过程中会发生性状的改变，甚至丢失。胚胎或精子的冷冻保存技术的应用可避免这种现象的发生。并在发育和研究中加强对动物肿瘤生长的生物学特性观察，同时利用PCR技术检测外源肿瘤基因在动物体内的表达，以防外源肿瘤基因的丢失。（一）乙型肝炎病毒（HBV）转基因动物肿瘤模型（二）乳腺癌转基因小鼠模型,三、体外肿瘤细胞迁移、侵袭能力检测模型（一）细胞划痕实验（Wound healing assay）【基本原理】上皮细胞，成纤维细胞，肿瘤细胞等，在生理状态下，常形成单层或者复层上皮细胞。在病理状态下，细胞迁移的时候则以侧向运动为主。细胞划痕实验
32、是将细胞单层培养在培养板上，待细胞融合后机械性地使小片细胞脱落，然后继续培养细胞，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移情况的实验，很好的模拟了这种侧向迁移运动，一直被用来检测细胞的迁移能力。,【操作步骤】（1）准备：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和Marker笔操作前要在超净台内紫外照射30min。（2）用Marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.51cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线（3）向孔中加入约106个细胞，因细胞增殖能力不同而略有不同，37,5%CO2孵育过夜，使细胞贴壁，铺满板底即可。（4）第二天，用200l的枪头在细胞表面进行划痕，枪头应尽量垂直于孔背后的横
33、线，可用直尺比着，枪头要垂直。（5）用PBS洗涤细胞3次，清除划下的细胞，然后加入低血清培养液（含1%2%FBS），放入孵箱，37,5%CO2孵育。（6）在024h内取不同的时间点拍照，通过计算划痕区域内无细胞区的面积统计细胞迁移情况。【结果判定】比较各组划痕区域内的细胞数目多少、计算划痕区域内无细胞区的大小或面积。【注意事项与模型评价】划痕法的优点：价格低廉，操作简单，细胞外围环境简单，容易控制。划痕法的不足：对细胞的要求高，适用的细胞系范围较窄。划痕实验要求细胞本身具有较强的迁移能力，且对无血清的培养环境有较强的忍受力，因此只适用于上皮、纤维样细胞系和部分肿瘤细胞系。,（二）Transwe
34、ll（Boyden小室）实验Transwell准确的说应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室或Boyden小室，是一类有通透性的杯状的装置，杯子底层的一张有通透性的膜，这层膜带有微孔，孔径大小有0.112.0m，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。,1.Matrigel侵袭实验【基本原理】肿瘤侵袭基底膜被认为是转移发生过程中的一个关键环节。肿瘤细胞最初穿过基底膜是它们侵入淋巴系统或血管床的开始，随后肿瘤细胞
35、通过血行散播或淋巴转移进入靶器官/组织，最终形成转移灶。为了体外分析评估肿瘤细胞的侵袭能力，人们研发了多个系统来评估细胞侵袭穿过基底膜的能力。一些实验利用组织的基底膜提取物，例如羊膜、鸡绒(毛)膜尿囊膜、晶状体囊膜和膀胱壁等。然而，由于组织本身的异质性，这些基质的实验重复性并不理想。而且，提取这些基质通常需要很长时间，技术上也很复杂。因此，人们研制出了同质性更好的细胞外基质来用于体外侵袭实验的研究。其中应用最广泛的就是Matrigel从一种富含细胞外基质蛋白的小鼠EngelbrethHolmSwarm肉瘤中提取的可溶性的基底膜。它主要包含层黏连蛋白型胶原、硫酸类肝素蛋白多糖等多种基底膜组分。在
36、实验室里，Matrigel加工应用起来相对简单。这部分的侵袭实验检测的是细胞黏附在基质胶上，侵袭进入和穿过基质，继而朝向趋化因子的方向迁移的能力。这些步骤被证明是肿瘤转移的关键环节。,【操作步骤】（1）Matrigel胶包被小室的制备1）解冻未开封的Matrigel溶液，置于冰上放入冰箱里，至少6h，推荐过夜解冻。遇冷所有的细胞培养板、Transwell小室或Boyden小室、无菌吸量管、小管。除非有所提示，否则所有的步骤都应该在无菌条件下进行。2）摇动瓶子使Matrigel更好溶解。吸取适量Matrigel稀释到所需要浓度。起始浓度可选择1.2 mg/ml,0.6 mg/ml,0.3 mg/
37、ml等，溶解于无血清培养基中。吸出5ml待用，剩余Matrigel应立即储存在20。3）室温无菌环境下，小心的吸取Matrigel溶液于小室膜的上方，轻轻转动小室，确保膜的上表面完全被包被住。（6孔板加入300 l，12孔板加入100l，24孔板加入40l）。在Matrigel上方非常小心的覆盖适量无菌双蒸水（6孔板加入200 l，12孔板加入100l，24孔板加入50l）。每组应至少做3个复孔。同时应准备无Matrigel的小室作为对照，以下步骤相同。4）将包被好Matrigel的小室置于37细胞培养箱中，通常30min1h。5）再水化Matrigel层：加入37无血清细胞培养基于细胞培养板
38、内（6孔板加入600 l，12孔板加入200l，24孔板加入75l），孵育Matrigel使其再水化约2h。对照小室同样进行此步骤的孵育。（2）胰酶消化法从培养瓶中获取细胞，用含1%FBS的培养基洗涤三遍，再用含1%FBS的培养基悬重细胞，使细胞的浓度达到（15）105个/ml.（3）Matrigel侵袭分析1）在下室中（滤膜下方）加入含有5%10%胎牛血清的细胞培养基，可根据需要在培养基中下室加入纤维黏连蛋白，滤膜和下室培养基之间应该不存在气泡。2）在对照孔的膜上方或实验组的Matrigel上方轻轻加入适量细胞悬液（6孔板加入2ml，12孔板加入1ml，24孔板加入0.25ml）。3）在37
39、，5%CO2培养箱中孵育一定时间（根据细胞迁移能力和实验要求选择孵育时间，例如可以选择12，24，36，72h等）。（4）结晶紫染色法收集下室细胞，并统计迁移到下室的细胞数。1）用棉签擦去基质胶和上室内的细胞2）从培养板中移去Transwell小室，倒置，风干。3）培养板中加入500l 0.1%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37孵育30min后取出，用PBS清洗。4）将小室正置于载玻片上，在倒置显微镜下观察细胞，照相，计细胞数。5）在培养板中加入适量33%醋酸，将小室置于其中，使膜浸没在液体中，振荡10min后取出小室，将培养板置于酶标仪上测570nm的OD值，间接反应细胞数。,
40、【注意事项与模型评价】（1）常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔板为最常用。根据实验需要选择不同孔径的Transwell小室。（2）Transwell侵袭实验应选择有侵袭力的细胞。（3）膜的下室面可涂上纤维黏连蛋白(fibronectin，FN，Sigma有售)，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）。（4）常用的染色方法还包括台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。若已将肿瘤细胞用荧光标记，则可收集细胞后用流式细胞术检测荧光标记的细胞数量。（5）也可不用Matrigel包被滤膜，而是直接在上室中加入细胞悬液，在下室中加入血清、某种趋化因子或另一种细胞悬液等，检测不同因素对细胞迁移和趋化作用的影响。（6）上层培养液：采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%0.2%BSA；下层培养液：下层常用含5%10%FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。,
