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1、专题26 基因工程,高考生物(江苏专用),考点1基因工程的工具与操作程序1.(2014江苏单科,23,3分)下列关于基因工程技术的叙述,错误的是(多选)()A.切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列B.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应C.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D.抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达,五年高考,A组自主命题江苏卷题组,答案ABC限制酶的识别序列多为6个核苷酸,也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,A错误;PCR反应中,起初的9095高温是使目的基因解旋,后冷却至50左右是使引物结
2、合到互补DNA链上,最后再加热至72左右是让DNA聚合酶催化DNA的子链延伸,B错误;载体质粒上的四环素抗性基因、青霉素抗性基因等抗生素抗性基因常作为标记基因,C错误;目的基因即使成功地插入到受体细胞染色体上,如果不是在启动子和终止子之间,也不能正常表达,D正确。,错因分析错答集中在C选项上。主要原因可能是:将“抗生素合成基因”误以为是“抗生素抗性基因”;可能是学生对抗生素抗性基因在基因工程操作中的作用还了解不够。,2.(2018江苏单科,32,8分)为生产具有特定性能的-淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了-淀粉酶基因(1 656个碱基对),利用基因工程大量制备-淀粉酶,实验流程见图。请回
3、答下列问题:(1)利用PCR技术扩增-淀粉酶基因前,需先获得细菌的。(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是。,(3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中的设定与引物有关,的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)变性温度退火温度延伸温度变性时间退火时间延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码-淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列:5-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU-3图中虚线框内mRNA片段包含个密码子,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第一个密码子最多有
4、种。(5)获得工程菌表达的-淀粉酶后,为探究影响酶活性的因素,以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性,结果如下:,根据上述实验结果,初步判断该-淀粉酶活性最高的条件为。,答案(8分)(1)基因组DNA(2)5使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连(3)(4)813(5)pH为8.5,缓冲液为50 mmol/L Tirs-HCl,解析(1)由题干信息可知某种海洋细菌含有-淀粉酶基因,因此在扩增-淀粉酶基因前需先从细菌中提取细菌的基因组DNA。(2)由于引物的作用是引导子链的延伸,将脱氧核苷酸连接到引物上时,是与引物的3端相连的,由此确定需在引物的5端加上限制性酶切位点。常在两条引物上加入不同
5、的限制酶切位点的主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体,防止自身相连。(3)进行PCR扩增时,退火的温度与引物长短和碱基种类有关。延伸时间长短的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基,该mRNA上5端为AUG(起始密码子),因此可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中的碱基,可得出共有8个密码子。由于虚线框后的第一个密码子已经固定为U,因此还有2个碱基未知,共可能有的种数为44=16,又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子,因此决定氨基酸的密码子最多有13种。(5)据表格数据可知:-淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50 mmol/L Tris-
6、HCl的条件下相对活性为99.5%,初步判断此条件下酶活性最高。,3.(2017江苏单科,33,8分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过获得用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物,中需要增加适当的位点。设计引物时需要避免引物之间形成,而造成引物自连。(3)图中步骤1代表,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成
7、一轮循环。(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有(填序号:升高退火温度降低退火温度重新设计引物)。,答案(8分)(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内切酶碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板GC含量高(5),解析本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。(1)依据题中表述现象分析,mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程,由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。(2)构建重组质粒时需要限制酶和DNA连
8、接酶,因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。(3)图中步骤1代表变性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。由于含G/C碱基对多的DNA稳定性强,因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。(5)温度过高不利于引物与模板结合;引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。,知识归纳关于引物的几个问题:引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,其长度通常为2030个核苷酸。由于PCR利用了DNA的热变性原理,因此温度的高低直接影响DNA变性、复性和延伸的过程,特别是复性的过程也即题中的退
9、火过程,它关乎引物是否能与模板链结合,只有结合后才有可能进行“延伸”。结合DNA结构特点,A与T之间有2个氢键、C与G之间有3个氢键的知识分析,引物中含碱基不同耐温程度不同,其中含C/G较多的引物,PCR扩增时温度可适当提高。,4.(2016江苏单科,33,9分)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点,其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题:,图1,图2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒,应选用两种限制酶切割,酶切后的载体和目的基因片段,通过酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒,需将其转入处于态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠
10、杆菌,应在筛选平板培养基中添加,平板上长出的菌落,常用PCR鉴定,所用的引物组成为图2中。(3)若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DNA末端连接,连接部位的6个碱基对序列为,对于该部位,这两种酶(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3A切图1质粒最多可能获得种大小不同的DNA片段。,答案(9分)(1)Bcl和Hind连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3)TGATCCACTAGG都不能(4)7,解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)分析4种限制酶识别的序列可知:BamH和Bcl识别序列中含有Sau3A的识别序列,这三种酶切割DNA后可以产生相同的黏性末端。为
11、保证质粒上含有标记基因,切割质粒时不能选用BamH和Sau3A,应选用Bcl和Hind两种限制酶切割;酶切后的载体和目的基因片段,需用DNA连接酶连接形成重组质粒,为了扩增重组质粒,需将其转入处于感受态的大肠杆菌中。(2)重组质粒中四环素抗性基因结构完整,氨苄青霉素抗性基因结构被破坏,在筛选平板培养基中添加四环素可以筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌。PCR扩增目的基因时,需用引物甲和引物丙两种引物。(3)BamH酶切产生的黏性末端为,Bcl酶切产生的黏性末端为,经DNA连接酶连接后,连接部位的6,个碱基对序列为,此序列不能被BamH和Bcl识别,因此不能被两种酶切开。(4)图1质粒中含有Sau3
12、A酶的3个识别序列,如图:(A、B、C分别表示相邻切点间的DNA片段),用Sau3A酶切,若在一个切点处切割可得到:B+C+A、C+A+B、A+B+C三种DNA片段(但其大小相同),若在两个切点处切割可得到:A、B+C、A+C、B、A+B、C六种DNA片段(其大小均不同);若在三个切点处均切割,可得到A、B、C三种大小不同的DNA片段,综上所述,用Sau3A酶切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。,疑难突破准确识别出BamH酶和Bcl酶识别序列中含有Sau3A酶的识别序列,是准确解答本题的关键。注意第(4)小题,Sau3A酶可能打开1个切点、2个切点和3个切点三种情况。,5.(2015江
13、苏单科,32,9分)胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方法所用的基因表达载体,图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示-半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题:图1,图2,(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是。(2)图1中启动子是酶识别和结合的部位,有了它才能启动目的基因的表达;氨苄青霉素抗性基因的作用是。(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有。(4)-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达,可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部,其意义在于。(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键,用溴化氰处理相应的
14、融合蛋白能获得完整的A链或B链,且-半乳糖苷酶被切成多个肽段,这是因为。(6)根据图2中胰岛素的结构,请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是,理由是。,答案(9分)(1)终止子(2)RNA聚合作为标记基因,将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来(3)限制酶和DNA连接酶(4)防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解(5)-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸,而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸(6)至少2个两条肽链的一端各有一个游离的氨基,氨基酸R基团中可能还含有游离的氨基,解析(1)完整的基因表达载体应包含目的基因、启动子、终止子、标记基因等,图1中没有标注出终止子。(2)启动子是RNA聚合酶识
15、别和结合的部位,可驱动转录出mRNA;氨苄青霉素抗性基因属于标记基因,可利用含氨苄青霉素的培养基筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(3)构建基因表达载体需用限制酶分别切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶将两者连接形成重组质粒。(4)利用-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达的意义是将胰岛素肽链上的蛋白酶切割位点隐藏在-半乳糖苷酶内部,从而防止胰岛素A链或B链被大肠杆菌体内的蛋白酶降解。(5)根据溴化氰的作用特点可知,溴化氰可将-半乳糖苷酶切成多个肽段,但不会切割胰岛素A、B链,这与肽链中含有的甲硫氨酸数量有关。(6)由于每条肽链的一端都含有一个游离的氨基,所以蛋白质分子中游离氨基的数量=肽链数+R
16、基上游离氨基数,故可推测胰岛素(由A、B链组成)至少含有2个游离的氨基。,易错警示基因表达载体几个组成部分中,启动子和终止子是常考查的内容,也是易与mR-NA上起始密码子和终止密码子相混淆的知识。避免将“游离氨基”与“氨基残基”混淆。,考点2基因工程的应用与蛋白质工程,B组 统一命题省（区、市）卷题组,考点1基因工程的工具与操作程序1.(2018北京理综,5,6分)用Xho和Sal两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是()图1酶切位点图图2电泳结果示意图A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图2中酶切产物可用于构建重组DNAC.泳道中是
17、用Sal处理得到的酶切产物D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA,答案D图1中,两种限制性核酸内切酶的酶切位点不同,说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同,A正确。图2中,两种酶的酶切产物都为DNA片段,都可用于构建重组DNA,B正确。结合图1的酶切位点图,判断两种酶切DNA后得到的DNA片段数;再结合泳道电泳结果知,泳道是用Sal处理得到的酶切产物,C正确。能被限制性核酸内切酶酶切的DNA片段仍为双链DNA,D错误。,知识拓展为什么现代基因工程不使用同一种限制酶?为防止载体或目的基因发生自身环化,我们常用不同的限制酶分别处理目的基因和载体,使目的基因两侧及载体各自具有两个不同的末端。,
18、2.(2017北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是()A.用限制性核酸内切酶EcoR和连接酶构建重组质粒B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞,D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上,答案C本题主要考查基因工程的相关知识。由于C基因两端及质粒上均存在限制酶EcoR的酶切位点,因此,可采用限制酶EcoR和DNA连接酶构建重组质粒;用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织(即农杆菌转化法),可以将C基因
19、导入细胞;由于质粒上存在潮霉素抗性基因(标记基因),因此,可以在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细胞,C符合题意;可用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上。,3.(2014广东理综,25,6分)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示,下列叙述正确的是(双选)()A.过程需使用逆转录酶B.过程需使用解旋酶和PCR获取目的基因C.过程使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备D.过程可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞,答案AD由mRNA形成cDNA需要逆转录酶,A正确;过程需要使用限制酶和PCR技术获得并扩增目的基因,B错误;过程使用的感受态细胞可用CaC
20、l2溶液制备,C错误;工程菌是指用基因工程方法,使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系,所以过程可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞,D正确。,4.(2018课标全国,38,15分)生物选修3:现代生物科技专题回答下列问题:(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶
21、肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加的抑制剂。,答案(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶,解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞,且重组质粒在不同细胞中能正常表达,说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同,生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,常用Ca2+处理大肠杆菌,使
22、之处于感受态,即Ca2+参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌,故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏,可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。,知识归纳目的基因导入受体细胞的方法(1)若受体细胞为植物细胞:基因枪法、花粉管通道法、农杆菌转化法。(2)若受体细胞为动物细胞:显微注射法。(3)若受体细胞为大肠杆菌:感受态细胞法。,5.(2017课标全国,38,15分)生物选修3:现代生物科技专题真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中没有,原核生物没有真核
23、生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题:(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原因是。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用作为载体,其原因是。(3)若要高效地获得蛋白A,可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比,大肠杆菌具有(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用的检测物质是(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献,也可以说是基,
24、因工程的先导,如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示,那么,这一启示是。,答案(1)基因A有内含子,在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除,无法表达出蛋白A(2)噬菌体噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕(3)繁殖快、容易培养(4)蛋白A的抗体(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,解析本题主要涉及基因文库与cDNA文库的差异、基因工程的步骤、基因工程产物的检测方法等知识,意在考查考生提取知识、分析和归纳知识的能力。(1)真核生物和原核生物的基因结构不同,真核生物的基因中存在内含子等不能编码蛋白质的序列,原核生物的基因中不存在内含子。真核生物在基因表达时
25、,转录出的RNA需要将内含子对应的RNA序列切除后才可进行翻译。从人的基因组文库中获得的基因 A 中含有内含子,而作为原核生物的大肠杆菌不能切除内含子对应的RNA序列,故基因 A 在大肠杆菌中无法表达出蛋白A。(2)病毒对宿主细胞的侵染具有特异性,噬菌体是专门侵染细菌的病毒,不能侵染家蚕细胞,故可选用可感染家蚕的昆虫病毒作为载体。(3)与真核生物相比,大肠杆菌等原核生物具有繁殖快、容易培养、遗传物质相对较少等优点,因此在基因工程中常用原核生物作为受体细胞。(4)检测基因A 是否翻译出蛋白A,一般用抗原抗体杂交的方法,即用蛋白 A 的抗体与从细胞中提取的蛋白质进行杂交,观察是否出现杂交带。(5)
26、肺炎双球菌转化实验的实质是 S型菌的 DNA 进入 R 型菌体内,并可在 R 型菌体内完成表达,这证明了 DNA 可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,为基因工程奠定了理论基础。,知识拓展真核生物基因中通常有内含子,原核生物的基因中不含有内含子,原核生物不能切除内含子转录的RNA序列,故基因工程中不能将真核生物的基因直接导入原核生物,而常使用反转录的方法先获得真核生物的cDNA(不含内含子),再进行下一步操作。,6.(2017课标全国,38,15分)生物选修3:现代生物科技专题几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分,几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内,可增强其抗真菌病
27、的能力。回答下列问题:(1)在进行基因工程操作时,若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA,常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料,原因是。提取RNA时,提取液中需添加RNA酶抑制剂,其目的是。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA,其原理是。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是(答出两点即可)。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时,DNA连接酶催化形成的化学键是。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高,根据中心法则分析,其可能的原因是。,答案(1)嫩叶组织细胞易破碎防止RNA降解(2)在逆转录酶
28、的作用下,以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA(3)目的基因无复制原点;目的基因无表达所需启动子(4)磷酸二酯键(5)目的基因的转录或翻译异常,解析本题主要考查基因工程的相关知识,考查学生获取知识,分析与归纳知识等能力。(1)从植物体中提取mRNA需要破碎组织细胞,嫩叶比老叶的组织细胞易破碎,mRNA提取效率高。由于植物组织中存在的RNA酶能将RNA分解,所以实验过程中要添加RNA酶抑制剂以降低RNA酶的活性,保护提取的RNA不被分解。(2)cDNA是在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板,按照碱基互补配对的原则合成的。(3)由于目的基因无复制原点,也无基因表达所需的启动子和终
29、止子,所以需与质粒构建重组质粒后再导入受体细胞。(4)DNA连接酶可以催化两个DNA片段的黏性末端或平末端连接形成磷酸二酯键。(5)几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中,但是转基因植株抗真菌病的能力没有提高,说明转基因植株体内不存在抗菌活性蛋白,即几丁质酶基因的转录或翻译过程出现异常,从而导致几丁质酶基因没有正常表达合成抗菌活性蛋白。,知识归纳走出基因工程的5大易混点(1)限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别特定的碱基序列,并在特定的位点上进行切割;限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)切取目的基因与切割载体时“只能”使用“同一种酶
30、”?在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶,以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。为了避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,使目的基因和载体各具有两个不同的黏性末端。(3)启动子起始密码子,终止子终止密码子启动子:一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子:一段有特殊结构的DNA短片段,位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。,起始密码子和终止密码子位于mRNA上,分别控制翻译过程的启动和终止。(4)目的基因的插入位点不是随意
31、的:基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因的插入位点应在启动子与终止子之间,若目的基因插在启动子内部,启动子将失去原功能。(5)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。第一步用PCR或人工合成法获得DNA过程中存在碱基互补配对,第二步黏性末端连接时存在碱基互补配对,第四步分子杂交及基因表达时存在碱基互补配对。,考点2基因工程的应用与蛋白质工程1.(2014重庆理综,4,6分)如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述,正确的是(),A.的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B.侵染植物细胞后,重组Ti质粒整合到的染色体上C.的染色体上
32、若含抗虫基因,则就表现出抗虫性状D.只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异,答案D的构建需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶参与,A错误;侵染植物细胞后,通过农杆菌的转化作用,使目的基因进入植物细胞并整合到的染色体上,B错误;的染色体上含有目的基因(抗虫基因)但不一定表达,C错误;基因工程依据的原理是基因重组,基因重组属于可遗传变异,D正确。,2.(2015海南单科,31,15分)在体内,人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链,此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原,进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后,产生A、B两条肽链,再经酶丙作用生成由51个氨
33、基酸残基组成的胰岛素。目前,利用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题:(1)人体内合成前胰岛素原的细胞是,合成胰高血糖素的细胞是。(2)可根据胰岛素原的氨基酸序列,设计并合成编码胰岛素原的序列,用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体,再经过细菌转化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成的基因工程菌。(3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时,培养液无抗原抗体反应,菌体有抗原抗体反应,则用该工程菌进行工业发酵时,应从中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。,答案(1)胰岛B细胞胰岛A细胞(每空3分,共6分)(2)DNA胰岛素原(每空3分,共6分)(3)菌体(3分),解
34、析(1)人体合成前胰岛素原的细胞是胰岛B细胞,合成胰高血糖素的细胞是胰岛A细胞。(2)蛋白质工程生产胰岛素时,需根据胰岛素原的氨基酸序列,设计并合成编码胰岛素原的脱氧核苷酸序列(目的基因),然后再构建胰岛素原基因重组表达载体,导入细菌细胞内,再经过细菌转化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成胰岛素原的工程菌。(3)运用抗原抗体检测法检测胰岛素原时,培养液无抗原抗体反应,菌体有抗原抗体反应,故应从菌体中分离、纯化胰岛素原。,C组教师专用题组,考点1基因工程的工具与操作程序1.(2013江苏单科,22,3分)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应,为了克服这个缺陷,可选择性扩增抗体
35、的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是(多选)()A.设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列B.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列C.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞,答案BD本题主要考查PCR技术的有关知识。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列设计引物,但不需知道目的基因的全部序列,需要考虑载体的序列;因PCR反应在高温条件下进行,故反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶;因某些目的基因编码的产物需经特殊的加工修饰过程,故一定要根据
36、目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞。,2.(2012江苏单科,32,9分)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列,图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp、BamH、Mbo、Sma4种限制性核酸内切酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问题:图1,图2(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由连接。(2)若用限制酶Sma完全切割图1中DNA片段,产生的末端是末端,其产物长度为。(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的
37、DNA片段,用限制酶Sma完全切割,产物中共有种不同长度的DNA片段。,(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒,那么应选用的限制酶是。在导入重组质粒后,为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌,一般需要用添加的培养基进行培养。经检测,部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达,其最可能的原因是。,答案(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖(2)平537 bp、790 bp、661 bp(3)4(4)BamH抗生素B同种限制酶切割形成的末端相同,部分目的基因D与质粒反向连接,解析本题主要考查基因工程中限制酶的作用原理和重组质粒构建的相关知识。(1)通过分析DNA分子
38、结构的特点可知,在DNA的一条链中,相邻两个碱基依次由脱氧核糖磷酸脱氧核糖连接。(2)限制酶Sma的识别序列和酶切位点为CCCGGG,酶切位点位于识别序列的中轴线上,所以酶切后形成的末端是平末端。在图1DNA片段中,有两个Sma的识别序列,完全切割后形成的产物长度分别为:534 bp+3 bp=537 bp;796 bp-3 bp-3 bp=790 bp;658 bp+3 bp=661 bp。(3)D基因突变为d基因后,其碱基序列中只含有一个Sma的识别序列,此时用Sma完全切割该DNA片段后产物的长度有两种,分别为:534 bp+796 bp-3 bp=1 327 bp;658 bp+3 b
39、p=661 bp。所以,从杂合子(Dd)中分离出的D、d基因如图1对应的DNA片段被Sma完全切割,产物中有537 bp、790 bp、661 bp、1 327 bp 4种不同长度的DNA片段。(4)分析图1DNA片段上的限制酶酶切位点可知,为了防止目的基因被破坏,并将目的基因从DNA片段中切下来,可选择用BamH或Mbo对目的基因进行处理。质粒用Mbo处理后抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因都会被破坏,质粒用BamH处理后,会破坏抗生素A抗性基因,但抗生素B抗性基因正常,所以应选用的限制酶是BamH。筛选含重组质粒的大肠杆菌时,一般需用添加抗生素B的培养基进行培养。因为用同种限制酶处理后目的
40、基因和质粒上形成的黏性末端完全相同,所,以部分目的基因D可能会反向连接在质粒上,此类重组质粒上的目的基因D将不能正确表达。,3.(2011江苏单科,33,8分)请回答基因工程方面的有关问题:(1)利用PCR技术扩增目的基因,其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA片段,它是子链合成延伸的基础。,从理论上推测,第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为。在第轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图),请分别说明理由。,第1组:;第2组:。(3)PCR反应
41、体系中含有热稳定DNA聚合酶,下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能,这是因为。,(4)用限制酶EcoR V、Mbo单独或联合切割同一种质粒,得到的DNA片段长度如下图(1 kb即1 000个碱基对),请画出质粒上EcoR V、Mbo的切割位点。,答案(1)15/16三(2)引物和引物局部发生碱基互补配对而失效引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上(4)见图,解析(1)依据图解特点,第四轮循环产物中可以得到16个DNA分子,其中有15个含引物A的单链、15个含引物B的单链,以及一个不含引物A和一个不含引物B的模板链
42、。从图解原DNA与引物A、B的比例关系分析,经三次复制后开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)比较第一组引物的碱基顺序,可以发现引物与引物有两对碱基能发生互补配对,形成局部双链结构而失效;而第二组引物中,引物折叠后会发生碱基互补配对而导致失效。(3)在PCR反应体系中,引物首先与模板DNA单链互补配对形成局部双链DNA片段,然后在DNA聚合酶的作用下将单个脱氧核苷酸依次连接到引物链上。(4)分析本小题中图解可知,用EcoR V切割质粒只得到长度为14 kb的一个片段,说明该酶在质粒上只有1个切点;同理可以推测Mbo在质粒上有2个切点;由图中可以看出同时用两种限制酶切割时得到了3个片段
43、,由此可以推测限制酶EcoR V的切点在图中11.5 kb的DNA片段中。具体切割位点见答案。,4.(2010江苏单科,27,8分)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题:,(1)一个图1所示的质粒分子经Sma切割前后,分别含有个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造,插入的Sma酶切位点越多,质粒的热稳定性越。,(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒,不能使用Sma切割,原因是。(4)与只使用EcoR 相比较,使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止。(5)为了获取重组质粒,将切割后的
44、质粒与目的基因片段混合,并加入酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了。(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因,将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体,然后在的培养基中培养,以完成目的基因表达的初步检测。,答案(8分)(1)0、2(2)高(3)Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因(4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)DNA连接(6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞(7)蔗糖为唯一含碳营养物质,解析本题综合考查基因工程的过程及应用。(1)质粒是双链环状DNA分子,在Sma切割前没有游离的磷酸基团,Sma作用于两个核苷酸之间的磷酸二酯键,切割产生的
45、DNA片段末端是平末端,因而质粒经切割后含有2个游离的磷酸基团。(2)质粒的热稳定性主要由氢键的数量决定,氢键数量越多,质粒的热稳定性越高,反之则低,DNA分子中A与T之间存在2个氢键,C与G之间存在3个氢键,因此DNA分子中G-C碱基对越多,热稳定性就越高,Sma识别CCCGGG序列,并在C和G之间将这段序列切开,也就是质粒中Sma酶切位点越多,G-C碱基对越多,热稳定性越高。(3)据图1可知,Sma切割的位点在抗生素抗性基因之中,抗生素抗性基因是标记基因,应尽量避免破坏,据图2可知Sma切割的位点在目的基因之中,破坏了目的基因,所以不能使用Sma切割。(4)用同种限制酶切割后的质粒和目的基
46、因,在基因表达载体构建时,常形成三种连接方式,其中目的基因与目的基因的连接、质粒与质粒的连接是无效的连接,用两种限制酶可避免此类现象。(5)基因表达载体的构建过程中需加DNA连接酶,连接脱氧核糖和磷酸。(6)抗生素抗性基因属于标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。(7)目的基因是蔗糖转运蛋白基因,将其导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后,应进行目的基因的检测与鉴定,可根据受体细胞是否含有蔗糖转运蛋白,即是否具备吸收蔗糖的能力判断基因工程是否成功,因而可在含有蔗糖(唯一碳源)的培养基中培养。,5.(2016课标全国,40,15分)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相
47、应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后,与用BamH酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有(答出两点即可),而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。,(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的
48、细胞是不能区分的,其原因是;并且和的细胞也是不能区分的,其原因是。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有的固体培养基。(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自。,答案(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞,解析(1)质粒作为载体应具备的基本条件有:能自我复制、具有标记基因、含有一至多个限制酶切割位点等。(2)由题意可知,未被转化的和仅
49、含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因,所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因,所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能,所以可用含有四环素的培养基,筛选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落。(3)噬菌体属于病毒,病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自受体细胞。,知识归纳标记基因要点总结:一般将一些抗性基因作为标记基因;标记基因的主要作用是鉴定和筛选含有目的基因的受体细胞;标记基因
50、表达产物对什么物质有抗性,在筛选培养时则在培养基中加入什么物质;标记基因若被插入了外源DNA片段,则该标记基因会被破坏。,6.(2016天津理综,7,12分)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,只能从人血浆中制备。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。(1)为获取HSA基因,首先需采集人的血液,提取合成总cDNA,然后以cDNA为模板,使用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向,请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。(2)启动子通常具有物种及组织特异性,构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体,需要选择的启动子是(填写字母
