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1、现代生物科技专题,1.2基因工程的基本操 作 程 序,学习目标,1、简述基因工程的原理和技术。2、明确获取目的基因的途径、基因表达载体的模式结构、将目的基因导入受体细胞的技术和目的基因的检测与鉴定的方法。,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些工作？,普通棉花抗虫棉,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的表达和检测,基因工程的基本操作程序,1.2基因工程的基本操作程序,第一课时,本课时目标：,1、说出基因工程的四步基本操作程序2、叙述反转录法获取目的基因的过程3、说出基因文库
2、的概念及两种类型4、说明PCR技术的原理、条件及过程,基因工程的目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。,与生物抗逆性相关的基因与优良品质相关的基因与生物药物和保健品相关的基因与毒物降解相关的基因与工业所需酶相关的基因具有调控作用的因子,1、人工合成,(基因比较小，序列已知),目的基因的获取,DNA合成仪,1）反转录法：,聚焦二：目的基因的获取方法,cDNA(互补DNA),蛋白质,mRNA,DNA,DNA,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,1）反转录法：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,
3、目的基因的获取,cDNA,2、从基因文库中获取,(基因序列未知),目的基因的获取,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1)基因组文库(Genomic library),是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库,
4、2)cDNA文库(cDNA library),反转录酶,mRNA,cDNA,图书馆,国家图书馆,市图书馆,基因文库,基因组文库,部分基因文库,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,从基因文库中得到目的基因的方法,聚焦二：目的基因的获取方法,5/,3/,5/,3/,高温变性,聚焦二：目的基因的获取方法,5/,3/,5/,3/,90-95,55-65,70-75,3、利用PCR技术扩增目的基因,聚合酶链式反应,目的基因的获取,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形
5、成_,b、复性（55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR扩增仪,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_、_.等,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）,PCR技术,1、PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。P
6、CR过程一般经历下述三十多次循环：95下使模板DNA变性、解链55下复性（引物与DNA模板链结合）72下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高,C,2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸460 个），放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A540 个
7、B7560个 C8100 个 D17280 个,C,获取目的基因的常用方法有哪些?,（2）从基因文库中获取目的基因序列未知,（3）利用PCR技术扩增目的基因序列已知,（1）人工合成-目的基因不是很大且已知序列,目的基因的获取,3、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工化学合成A.B.C.D.,4、在基因工程技术中，下列方法与目的基因获得无关的是A.辐射诱变法 B.从基因文库中获取 C.反转录法 D.人工合成法,科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，
8、然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,聚焦三：基因表达载体的构建,作为基因表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,1、基因表达载体包括哪些必需组分？2、将目的基因导入植物、动物、微生物细胞的方法分别有哪些？3、目的基因的检测有哪些方法？,阅读课本P11-15，思考以下问题：,基因表达载体的构建,基因表达载体的构建是基因工程的核心，其目的是使目
9、的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,基因表达载体的构建,基因表达除含有目的基因外，还需要哪些元件？,启动子终止子标记基因,一 原核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区上游,编码区下游,调控遗传信息的表达(调控序列),一 原核细胞的基因结构,与RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合，能催化DNA转录为RNA,启动子,终止子,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA
10、片断，能终止mRNA的转录,一 原核细胞的基因结构,与RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶,RNA聚合酶,启动子,终止子,二 真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,调控遗传信息的表达(调控序列),外显子(能编码蛋白质),内含子(不能编码蛋白质),启动子,终止子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,原核细胞不具有剪切、拼接mRNA的能力，所以真核细胞的基因不能在原核细胞的受体细胞中正确表达,成熟mRNA,反转录,反转录法合成目的基因,cDNA不含非编码区的启动子、终止子 不含编码区的内含子,质疑 从cDNA文库中获取的目的基因没有启动子，如果要实现将编码序列导
11、入受体生物中并成功表达，基因表达载体还需哪些元件？,基因表达载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,聚焦三：基因表达载体的构建,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,e、复制原点,质粒,目的基因,限制酶,运载体,目的基因,限制酶切,同一种,黏性末端,黏性末端,DNA连接酶,重组DNA分子,有几种重组DNA？,基因表达载体的构建,质粒,DNA分子,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种 限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,
12、聚焦三：基因表达载体的构建,哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因,2、科学家已经能够通过基因工程的方法，能使番茄果肉细胞中含有人奶蛋白。以下有关该基因工程的叙述错误的是（）A采用反转录的方法得到的目的基因有启动子、终止子 B用同种限制酶处理质粒和含目的基因的DNA，可产生相同的黏性末端而形成重组DNA分子 C番茄的叶肉细胞可作为受体细胞 D启动子对于目的基因在番茄的叶肉细胞中的表达是不可缺少的,1、哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因,将目的基因导入受体细胞,转化,目的基因进入受体细胞内，并且在
13、 受体细胞内维持稳定和表达的过程。,阅读P12-13，思考：将目的基因导入植物细胞、动物细胞、微生物细胞的方法分别有哪些？,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术感受态法,受体细胞,植物细胞,动物细胞,原核细胞,植物肿瘤,农杆菌转化法,适用于双子叶植物裸子植物,适用于单子叶植物,基因枪法,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,花粉管通道法,适用于被子植物,将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精）显微注射 受精卵 新性状动物,将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：,用Ca2+处
14、理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,1、基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是()A结构简单，操作方便B繁殖速度快C遗传物质含量少、简单D性状稳定,变异少,B,阅读p13-15，思考：1、受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？2、目的基因是否稳定的存在于转基因生物并按人们的预期进行表达，需要在那些水平上进行检测？,目的基因的表达和检测,目的基因的表达和检测,接种实验,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂交法,DNA分子杂交法,DNA分子杂交,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补
15、的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,A-,A-,T-,T-,C-,G-,T-,探针,待测DNAX,待测DNAY,待测DNAY与探针DNA相同,检测目的基因是否导入受体细胞,目的DNA片段,目的基因,蛋白质,小鼠体内,抗体,目的基因,受体细胞,蛋白质,抗原,杂交分子,检测目的基因是否翻译成蛋白质,-抗原抗体杂交,具体做法是：第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到
16、硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。,检测目的基因是否翻译成蛋白质,-抗原-抗体杂交,个体生物学水平,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,1、目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是检测受体细胞是否有目的基因 检测受体细胞是否有致病基因 检测目的基因是否转录信使RNA 检测目的基因是否翻译蛋
17、白质 A.B.C.D.,C,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法、感受态法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：,3、利用基因工程生产蛋白质药物的方法之一是将人的基因转入动物体内，再饲养这些转基因动物，从动物乳汁或尿液中提取药物。这一过程不涉及 ADNA按照碱基互补配对原则自我复制 BDNA以其一条链为模板合成RNACRNA以自身为模板自我复制 D按照RNA密码子的排列顺序合成蛋白质,C,2）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操
18、作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,a,a,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分
19、子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪法（花粉管通道法）,植物组织培养,脱分化,再分化,耐盐基因,移栽到盐碱地等,4、酵母菌的维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用等，是提取核苷酸、三磷酸腺苷等多种生化产品的原料，还可用于生产维生素、氨基酸等。科学家将使啤酒产生丰富泡沫的LTPl基因植入啤酒酵母菌中，使其产生LTPl蛋白，酿出泡沫丰富的啤酒，具体的操作过程如下：请据图
20、回答问题：（1）图中LTPl基因与B结合产生的C是_，通常在体外完成，此过程必需有_和_酶。,DNA连接,基因表达载体,DNA限制性内切酶,4、酵母菌的维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用等，是提取核苷酸、三磷酸腺苷等多种生化产品的原料，还可用于生产维生素、氨基酸等。科学家将使啤酒产生丰富泡沫的LTPl基因植入啤酒酵母菌中，使其产生LTPl蛋白，酿出泡沫丰富的啤酒，具体的操作过程如下：（2）标记基因的作用是。,筛选转化成功的受体细胞,4、酵母菌的维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用等，是提取核苷酸、三磷酸腺苷等多种生化产品的原料，还可用于生产维生素、氨基酸等。科学家将使啤酒产生丰富泡沫的LTPl基因植入啤酒酵母菌中，使其产生LTPl蛋白，酿出泡沫丰富的啤酒，具体的操作过程如下：（3）检测LTPl基因在啤酒酵母菌中是否表达可以通_。,抗元抗体杂交法检测是否产生LTPl蛋白,答案：（1）a a（2）基因枪法（花粉管通道法）（3）植物组织培养（1分）脱分化（去分化）再分化（4）耐盐基因（目的基因）一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）,
