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1、考点1基因工程的工具与操作程序1.(2018北京理综,5,6分)用Xho和Sal两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是()图1酶切位点图图2电泳结果示意图A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图2中酶切产物可用于构建重组DNAC.泳道中是用Sal处理得到的酶切产物D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA,五年高考,答案D图1中,两种限制性核酸内切酶的酶切位点不同,说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同,A正确。图2中,两种酶的酶切产物都为DNA片段,都可用于构建重组DNA,B正确。结合图1的酶切位点图,判断两种酶切DNA后得到的DN
2、A片段数;再结合泳道电泳结果知,泳道是用Sal处理得到的酶切产物,C正确。能被限制性核酸内切酶酶切的DNA片段仍为双链DNA,D错误。,知识拓展为什么现代基因工程不使用同一种限制酶?为防止载体或目的基因发生自身环化,我们常用不同的限制酶分别处理目的基因和载体,使目的基因两侧及载体各自具有两个不同的末端。,2.(2017北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是()A.用限制性核酸内切酶EcoR和连接酶构建重组质粒B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞C.在培
3、养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上,答案C本题主要考查基因工程的相关知识。由于C基因两端及质粒上均存在限制酶EcoR的酶切位点,因此,可采用限制酶EcoR 和DNA连接酶构建重组质粒;用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织(即农杆菌转化法),可以将C基因导入细胞;由于质粒上存在潮霉素抗性基因(标记基因),因此,可以在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细胞,C符合题意;可用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上。,3.(2015北京理综,5,6分)在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中,不需要的是()A.用携带目的基因的
4、农杆菌侵染植物细胞B.用选择培养基筛选导入目的基因的细胞C.用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生质体融合D.用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽,答案C用农杆菌转化法获得的转基因细胞需经植物组织培养获得转基因个体,不需要经过原生质体融合过程,C错误。,4.(2014天津理综,4,6分)为达到相应目的,必须通过分子检测的是()A.携带链霉素抗性基因受体菌的筛选B.产生抗人白细胞介素-8抗体的杂交瘤细胞的筛选C.转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定D.21三体综合征的诊断,答案B根据受体菌是否对链霉素产生抗性进行携带链霉素抗性基因受体菌的筛选,不需要分子检测,A错误;用特定选择培养基筛选出的杂交瘤细
5、胞,还需要进行克隆化培养和抗体检测,才能获得足够多的能分泌抗人白细胞介素-8抗体的杂交瘤细胞,B正确;转基因抗虫棉是否具有抗虫特性,需要做抗虫的接种实验,C错误;21三体综合征可通过用显微镜直接观察体细胞中的21号染色体数目的方法进行检测,D错误。,5.(2018天津理综,10,14分)甲型流感病毒为RNA病毒,易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法,主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板,逆转录成对应DNA后,利用技术扩增,并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止
6、密码子的序列。与改造前的基因相比,改造后的基因表达时不能合成完整长度的,因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒,并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因,其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的进行分子杂交鉴定,筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞,并在补加的培养基中进行培养,则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA,翻译出改造病毒基因的完整蛋白,
7、产生大量子代病毒,用于制备疫苗。,特殊tRNA基因转录时,识别其启动子的酶是(单选)。A.病毒的DNA聚合酶B.宿主的DNA聚合酶C.病毒的RNA聚合酶D.宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖,没有致病性,因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比,该病毒活疫苗的优势之一是可引起免疫,增强免疫保护效果。,答案(1)PCR多肽(或蛋白质)(2)载体总RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)D(4)细胞,解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列,则改造后的基因转录合成的
8、mRNA中,终止密码子提前出现,将不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定,以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。(3)由(2)知,转基因宿主细胞含有的特殊tRNA基因转录的tR-NA,该tRNA的反密码子可与终止密码子配对,并可携带非天然氨基酸(Uaa),所以培养基中需补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因进行转录时,识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因该病毒疫苗具有侵染性,故可引起细胞免疫。,疑难突破1.由(1)中“个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列”可知,改造后的基因
9、表达时不能合成完整长度的多肽。,2.由(2)中特殊tRNA能与终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)可知,转基因宿主细胞可利用非天然氨基酸Uaa,所以培养基中需加入非天然氨基酸Uaa。,3.灭活了的病毒已不具有侵染性,因此,只能引起体液免疫;而具侵染性的病毒可引起细胞免疫。,6.(2018课标全国,38,15分)回答下列问题:(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌
10、体DNA通常需与组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加的抑制剂。,答案(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶,解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞,且重组质粒在不同细胞中能正常表达,说明目的基因在不同细胞中的表
11、达机制相同,生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,常用Ca2+处理大肠杆菌,使之处于感受态,即Ca2+参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌,故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏,可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。,知识归纳目的基因导入受体细胞的方法(1)若受体细胞为植物细胞:基因枪法、花粉管通道法、农杆菌转化法。(2)若受体细胞为动物细胞:显微注射法。(3)若受体细胞为大肠杆菌:感受态细胞法。,7.(2016课标全国,
12、40,15分)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后,与用BamH酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有(答出两点即可),而,作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄
13、青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是;并且和的细胞也是不能区分的,其原因是。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有的固体培养基。(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自。,答案(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞,解析(1)质粒作为载体应具备的基本条件有:能自我复
14、制、具有标记基因、含有一至多个限制酶切割位点等。(2)由题意可知,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因,所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因,所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能,所以可用含有四环素的培养基,筛选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落。(3)噬菌体属于病毒,病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自受体细胞。,知识归纳标记基因要点总结:一般将一些抗性
15、基因作为标记基因;标记基因的主要作用是鉴定和筛选含有目的基因的受体细胞;标记基因表达产物对什么物质有抗性,在筛选培养时则在培养基中加入什么物质;标记基因若被插入了外源DNA片段,则该标记基因会被破坏。,8.(2015江苏单科,32,9分,0.306)胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方法所用的基因表达载体,图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示-半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题:图1,图2,(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是。(2)图1中启动子是酶识别和结合的部位,有了它才能启动目的基因的表达;氨苄
16、青霉素抗性基因的作用是。(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有。(4)-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达,可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部,其意义在于。(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键,用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链,且-半乳糖苷酶被切成多个肽段,这是因为。(6)根据图2中胰岛素的结构,请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是,理由是。,答案(1)终止子(2)RNA聚合作为标记基因,将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来(3)限制酶和DNA连接酶(4)防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解(5)-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸,而胰岛素A、B链
17、中不含甲硫氨酸(6)至少2个两条肽链的一端各有一个游离的氨基,氨基酸R基团中可能还含有游离的氨基,解析(1)完整的基因表达载体应包含目的基因、启动子、终止子、标记基因等,图1中没有标注出终止子。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动转录出mRNA;氨苄青霉素抗性基因属于标记基因,可利用含氨苄青霉素的培养基筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(3)构建基因表达载体需用限制酶分别切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶将两者连接形成重组质粒。(4)利用-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达的意义是将胰岛素肽链上的蛋白酶切割位点隐藏在-半乳糖苷酶内部,从而防止胰岛素A链或B链被大肠杆菌体内的蛋白酶
18、降解。(5)根据溴化氰的作用特点可知,溴化氰可将-半乳糖苷酶切成多个肽段,但不会切割胰岛素A、B链,这与肽链中含有的甲硫氨酸数量有关。(6)由于每条肽链的一端都含有一个游离的氨基,所以蛋白质分子中游离氨基的数量=肽链数+R基上游离氨基数,故可推测胰岛素(由A、B链组成)至少含有2个游离的氨基。,易错警示基因表达载体的几个组成部分中,启动子和终止子是常考查的内容,也是易与mRNA上起始密码子和终止密码子相混淆的知识。避免将“游离氨基”与“氨基残基”混淆。,9.(2015江苏单科,33,8分,0.448)荧光原位杂交可用荧光标记的特异DNA片段为探针,与染色体上对应的DNA片段结合,从而将特定的基
19、因在染色体上定位。请回答下列问题:图1,图2(1)DNA荧光探针的制备过程如图1所示,DNA酶随机切开了核苷酸之间的键从而产生切口,随后在DNA聚合酶作用下,以荧光标记的为原料,合成荧光标记的DNA探针。(2)图2表示探针与待测基因结合的原理。先将探针与染色体共同煮沸,使DNA双链中,键断裂,形成单链。随后在降温复性过程中,探针的碱基按照原则,与染色体上的特定基因序列形成较稳定的杂交分子。图中两条姐妹染色单体中最多可有条荧光标记的DNA片段。(3)A、B、C分别代表不同来源的一个染色体组,已知AA和BB中各有一对同源染色体可被荧光探针标记。若植物甲(AABB)与植物乙(AACC)杂交,则其F1
20、有丝分裂中期的细胞中可观察到个荧光点;在减数第一次分裂形成的两个子细胞中分别可观察到个荧光点。,答案(1)磷酸二酯脱氧核苷酸(2)氢碱基互补配对4(3)62和4,解析本题主要考查DNA的结构、复制、有丝分裂和减数分裂的相关知识。(1)DNA酶可使DNA分子断裂成为片段,为限制酶,其作用为切开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。合成DNA分子的原料为4种脱氧核苷酸。(2)DNA分子受热变性,氢键断裂,解旋为单链。探针的碱基与染色体上的特定基因序列按照碱基互补配对的原则,形成杂交分子。由于每条染色单体含有一个DNA分子,一个DNA分子可以有2条荧光标记的片段,所以两条姐妹染色单体中最多有4条荧光标记的片段
21、,但只能观察到两个荧光点。(3)植物甲与植物乙杂交后代F1为AABC,在有丝分裂中期已完成了DNA复制,并且A和B都可以被荧光探针标记,所以可观察到6个荧光点。F1AABC在减数第一次分裂形成的两个子细胞分别含有A、AB,因此分别可观察到2和4个荧光点。,以下为教师用书专用,10.(2015广东理综,25,6分)下图为培育转基因山羊生产人-酪蛋白的流程图。下列叙述正确的是(双选)()A.过程所用的人-酪蛋白基因可从人cDNA文库中获得B.过程可选用囊胚期或原肠胚期的胚胎进行移植C.过程可使用胚胎分割技术扩大转基因山羊群体D.过程人-酪蛋白基因在细胞质内进行转录、翻译,答案AC胚胎移植一般选桑椹
22、胚或囊胚期胚胎进行移植,不能选用原肠胚,B错误;基因的转录发生在细胞核内,D错误。,11.(2014广东理综,25,6分)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示,下列叙述正确的是(双选)()A.过程需使用逆转录酶B.过程需使用解旋酶和PCR获取目的基因C.过程使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备D.过程可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞,答案AD由mRNA形成cDNA需要逆转录酶,A正确;过程需要使用限制酶和PCR技术获得并扩增目的基因,B错误;过程使用的感受态细胞可用CaCl2溶液制备,C错误;工程菌是指用基因工程方法,使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系
23、,所以过程可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞,D正确。,12.(2015重庆理综,6,6分)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述,正确的是()A.表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得B.表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点C.借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来D.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用,答案C由于人肝细胞中胰岛素基因不能表达,所以无法利用肝细胞mRNA反转录获得胰岛素基因,A项错误;表达载体的复制启动于复制原点,胰岛素基因的转录启动于启动子,B项错误;抗生素抗性基因是标记基因,作用是检测受体细胞中是否含
24、有目的基因,从而将含有胰岛素基因的受体细胞筛选出来,C项正确;启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,是转录的起点,而终止密码子位于mRNA上,在翻译中起作用,D项错误。,13.(2017课标全国,38,15分)真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中没有,原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题:(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原因是。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用作为载体,其原因是。(3)若要高
25、效地获得蛋白A,可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比,大肠杆菌具有(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用的检测物质是(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献,也可以说是基因工程的先导,如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示,那么,这一启示是。,答案(1)基因A有内含子,在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除,无法表达出蛋白A(2)噬菌体噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕(3)繁殖快、容易培养(4)蛋白A的抗体(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,解
26、析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)从人的基因组文库中获得的基因A中含有内含子,而大肠杆菌属于原核生物,故大肠杆菌不能切除基因A初始转录产物中与内含子对应的RNA序列,故基因A在大肠杆菌中无法表达出蛋白A。(2)由于病毒对宿主细胞的感染具有特异性,噬菌体只能寄生在细菌细胞中,不能感染家蚕细胞,故应选用可感染家蚕的昆虫病毒作为载体。(3)与真核生物相比,大肠杆菌等原核生物具有繁殖快、容易培养、遗传物质相对较少等优点。(4)检测基因A是否翻译出蛋白A,一般用抗原抗体杂交的方法,即用蛋白A的抗体与从细胞中提取的蛋白质进行杂交,观察是否出现杂交带。(5)肺炎双球菌转化实验的实质是S型菌的DNA进入
27、R型菌体内,并可在R型菌体内完成表达,这证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,为基因工程奠定了基础。,知识拓展真核生物基因中通常有内含子,原核生物的基因中不含有内含子,所以原核生物不能切除内含子转录的RNA序列,故基因工程中不能将真核生物的基因直接导入原核生物,而常使用反转录的方法先获得真核生物的cDNA(不含内含子),再进行下一步操作。,14.(2016江苏单科,33,9分)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点,其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题:,图1,图2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒,应选用两种限制酶切割,酶切后
28、的载体和目的基因片段,通过酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒,需将其转入处于态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌,应在筛选平板培养基中添加,平板上长出的菌落,常用PCR鉴定,所用的引物组成为图2中。(3)若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DNA末端连接,连接部位的6个碱基对序列为,对于该部位,这两种酶(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3A切图1质粒最多可能获得种大小不同的DNA片段。,答案(1)Bcl和Hind连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3)T GATC CA CTAG G都不能(4)7,解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1
29、)分析4种限制酶识别的序列可知:BamH和Bcl识别序列中含有Sau3A的识别序列,这三种酶切割DNA后可以产生相同的黏性末端。为保证质粒上含有标记基因,切割质粒时不能选用BamH和Sau3A,应选用Bcl和Hind两种限制酶切割;酶切后的载体和目的基因片段,需用DNA连接酶连接形成重组质粒,为了扩增重组质粒,需将其转入处于感受态的大肠杆菌中。(2)重组质粒中四环素抗性基因结构完整,氨苄青霉素抗性基因结构被破坏,在筛选平板培养基中添加四环素可以筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌。PCR扩增目的基因时,需用引物甲和引物丙两种引物。(3)BamH酶切产生的黏性末端为,Bcl酶切产生的黏性末端为,经DN
30、A连接酶连接后,连接部位的6个碱基对序列为,此序列不能被BamH和Bcl识别,因此不能被两种酶切开。(4)图1质粒中含有Sau3A酶的3个识别序列,如图:(A、B、C分别表示相邻切点间的DNA片段),用Sau3A酶切,若在一个切点处切割可得到:B+C+A、C+A+B、A+B+C三种DNA片段(但其大小相同),若在两个切点处切割可得到:A、B+C、A+C、B、A+B、C六种DNA片段(其大小均不同);若在三个切点处均切割,可得到A、B、C三种大小不同的DNA片段,综上所述,用Sau3A酶切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。,疑难突破准确识别出BamH酶和Bcl酶识别序列中含有Sau3A酶
31、的识别序列,是准确解答本题的关键。注意第(4)小题中要考虑到Sau3A酶可能打开1个切点、2个切点和3个切点三种情况。,15.(2016课标全国,40,15分)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。图(a)图(b),根据基因工程的有关知识,回答下列问题:(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接,理由是。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示。这三种重组子中,不能
32、在宿主细胞中表达目的基因产物的有,不能表达的原因是。图(c),根据基因工程的有关知识,回答下列问题:(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接,理由是。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有,不能表达的原因是。图(c),(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有和,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。,答案(1)Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(每空2分,共4分)(2)甲和丙(2分)甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中
33、目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录(3分,其他合理答案可酌情给分)(3)EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶(每空2分,共6分,其他合理答案可酌情给分),解析(1)分析图(a)可知,限制酶Sau3A与BamH切割DNA后形成的黏性末端相同,故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时,为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达,目的基因应插入在启动子和终止子之间,据此可判断甲、丙均不符合要求,目的基因均不能被转录。(3)常见的DNA连接酶有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶,其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末
34、端。,解后反思本题与2012年高考理综新课标卷第40题相类似,从而提醒我们:可以从历年高考真题中窥探国家考试中心出题者的命题方向与角度。,16.2016浙江自选,18(一)下面是关于获得能产生人干扰素大肠杆菌的问题。请回答:(1)用限制性核酸内切酶识别人干扰素基因和质粒中一段特定的并切割,然后用连接形成重组DNA。该质粒是一种含抗生素抗性基因的核酸分子。A.双链环状B.单链环状C.双链线状D.单链线状(2)将含人干扰素基因的重组质粒导入到大肠杆菌,经含有的培养基筛选等过程,最终获得能产生人干扰素的大肠杆菌。,答案(1)核苷酸序列DNA连接酶A(2)抗生素,解析(1)限制性核酸内切酶可以识别特定
35、的核苷酸序列并切割每一条链中特定部位的两个核苷酸间的磷酸二酯键,然后用DNA连接酶连接形成重组DNA。该大肠杆菌质粒是一种很小的双链环状DNA分子。(2)由于该质粒含有抗生素抗性基因,所以可以在含有抗生素的培养基中进行筛选,最终获得能产生人干扰素的大肠杆菌。,评析本题考查基因工程的原理及生态工程相关知识。难度较小。,17.(2015福建理综,33,10分)GDNF是一种神经营养因子,对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示),并导入到大鼠神经干细胞中,用于干细胞基因治疗的研究。请回答:图1,图2(1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中,使用胰蛋白酶
36、的目的是。(2)构建含GDNF基因的表达载体时,需选择图1中的限制酶进行酶切。(3)经酶切后的载体和GDNF基因进行连接,连接产物经筛选得到的载体主要有3种:单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。为鉴定这3种连接方式,选择Hpa酶和BamH酶对筛选得到的载体进行双酶切,并对酶切后的DNA片段进行电泳分析,结果如图2所示。图中第泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。(4)将正向连接的表达载体导入神经干细胞后,为了检测GDNF基因是否成功表达,可用相应的与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定密度时,需进行培养以得到更多数量的细胞,用于神经干细胞移植
37、治疗实验。,答案(1)使细胞分散开(2)Xho(3)(4)抗体传代,解析(1)因动物细胞体外培养时有接触抑制现象,故需用胰蛋白酶处理动物组织,使细胞分散开。(2)目的基因两端及载体DNA分子中均有Xho酶识别的核苷酸序列,故构建基因表达载体时,应用Xho酶切割DNA分子。(3)图示可知载体中酶Hpa与Xho切割点距离为100 bp,GDNF基因切割成600 bp和100 bp两种DNA片段,由正向连接的重组载体中GDNF基因方向与Hpa、Xho酶切割结果可知,正向连接的重组载体被酶Hpa和酶Xho切割后,将得到6 000 bp和700 bp两种DNA片段,即为。(4)可用抗原抗体杂交原理,对目
38、的基因是否表达进行检测。当培养液中的细胞达到一定密度后,可分瓶进行传代培养,以获得更多数量的细胞。,考点2PCR技术及基因工程的应用1.(2018江苏单科,32,8分)为生产具有特定性能的-淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了-淀粉酶基因(1 656个碱基对),利用基因工程大量制备-淀粉酶,实验流程见图。请回答下列问题:(1)利用PCR技术扩增-淀粉酶基因前,需先获得细菌的。(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是。,(3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中的设定与引物有
39、关,的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)变性温度退火温度延伸温度变性时间退火时间延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码-淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列:5-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU-3图中虚线框内mRNA片段包含个密码子,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第一个密码子最多有种。(5)获得工程菌表达的-淀粉酶后,为探究影响酶活性的因素,以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性,结果如下:,根据上述实验结果,初步判断该-淀粉酶活性最高的条件为。,答案(1)基因组DNA(2)5使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连(3)(4)813(5)pH为8.5,缓冲液为
40、50 mmol/L Tirs-HCl,解析(1)由题干信息可知某种海洋细菌含有-淀粉酶基因,因此在扩增-淀粉酶基因前需先从细菌中提取细菌的基因组DNA。(2)由于引物的作用是引导子链的延伸,将脱氧核苷酸连接到引物上时,是与引物的3端相连的,由此确定需在引物的5端加上限制性酶切位点。常在两条引物上加入不同的限制酶切位点的主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体,防止自身相连。(3)进行PCR扩增时,退火的温度与引物长短和碱基种类有关。延伸时间长短的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基,该mRNA上5端为AUG(起始密码子),因此可依据三个碱基是一个密
41、码子来分析图中虚线框中的碱基,可得出共有8个密码子。由于虚线框后的第一个密码子已经固定为U,因此还有2个碱基未知,共可能有的种数为44=16,又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子,因此决定氨基酸的密码子最多有13种。(5)据表格数据可知:-淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl的条件下相对活性为99.5%,初步判断此条件下酶活性最高。,2.(2017天津理综,9,20分)玉米自交系(遗传稳定的育种材料)B具有高产、抗病等优良性状,但难以直接培育成转基因植株,为使其获得抗除草剂性状,需依次进行步骤、试验。.获得抗除草剂转基因玉米自交系A,技术路线如下图。(1)为防
42、止酶切产物自身环化,构建表达载体需用2种限制酶,选择的原则是(单选)。Ti质粒内,每种限制酶只有一个切割位点G基因编码蛋白质的序列中,每种限制酶只有一个切割位点酶切后,G基因形成的两个黏性末端序列不相同酶切后,Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同A.B.C.D.(2)下表是4种玉米自交系幼胚组织培养不同阶段的结果。据表可知,细胞脱分化时使用的激素是,自交系的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。,(3)农杆菌转化愈伤组织时,T-DNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。筛选转化的愈伤组织,需使用含的选择培养基。(4)转化过程中,愈伤组织表面常残留农杆菌,导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。
43、含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达,其产物能催化无色物质K呈现蓝色。用K分别处理以下愈伤组织,出现蓝色的是(多选)。A.无农杆菌附着的未转化愈伤组织B.无农杆菌附着的转化愈伤组织C.农杆菌附着的未转化愈伤组织D.农杆菌附着的转化愈伤组织(5)组织培养获得的转基因植株(核DNA中仅插入一个G基因)进行自交,在子代含G基因的植株中,纯合子占。继续筛选,最终选育出抗除草剂纯合自交系A。,答案(1)A(2)2,4-D乙(3)除草剂(4)BD(5),解析(1)利用双酶切可有效防止出现限制酶切割后的产物(目的基因、载体)发生自身环化及目的基因与载体的任意连接现象。这要求每种限制酶在Ti质粒内只有
44、一个切割位点,含目的基因的DNA片段被两种限制酶切割形成的黏性末端碱基序列不同。(2)细胞脱分化形成愈伤组织。表格信息显示,使用了2,4-D促使细胞脱分化。作为转化受体的幼胚,不仅要易脱分化,而且还要易再分化生芽、生根,故乙的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。(3)构建的基因表达载体中有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因(除草剂抗性基因位于T-DNA片段上),因利用农杆菌转化法转基因时,只有T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上,故需使用含除草剂的培养基筛选转化的愈伤组织。(4)因“含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达”,只有细胞内含有报告基因(成功转化)的愈伤组织,用K处理后出现蓝色
45、,故选BD。(5)转基因植株相当于携带G基因的杂合子,转基因植株自交,后代有3/4植株携带G 基因,其中纯合子占1/3。,易错警示转基因植物培育过程中,筛选成功转化的植物受体细胞的标准利用农杆菌转化法完成植物细胞转基因时,因只有Ti质粒的T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上,故筛选转化的植物受体细胞只能借助T-DNA片段上的特殊基因作为筛选标准,而Ti质粒上的非T-DNA片段未导入植物受体细胞,在对转化后的受体细胞筛选时不能以此作为选择标准。,3.(2017江苏单科,33,8分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建
46、转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过获得用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物,中需要增加适当的位点。设计引物时需要避免引物之间形成,而造成引物自连。(3)图中步骤1代表,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以
47、采取的改进措施有(填序号:升高退火温度降低退火温度重新设计引物)。,答案(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内切酶碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板GC含量高(5),解析本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。(1)依据题中表述现象分析,mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程,由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。(2)构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶,因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。(3)图中步骤1代表变性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。由于含G/C碱基对多的DNA
48、稳定性强,因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。(5)温度过高不利于引物与模板结合;引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。,知识归纳关于引物的几个问题:引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,其长度通常为2030个核苷酸。由于PCR利用了DNA的热变性原理,因此温度的高低直接影响DNA变性、复性和延伸的过程,特别是复性的过程即题中的退火过程,它关乎引物是否能与模板链结合,只有二者结合后才有可能进行“延伸”。结合DNA的结构特点,A与T之间有2个氢键、C与G之间有3个氢键的知识分析,引物中含碱基不同则耐温程度不同,其中含C/G较多的引物,PCR扩增时温度可
49、适当提高。,4.(2016天津理综,7,12分)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,只能从人血浆中制备。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。(1)为获取HSA基因,首先需采集人的血液,提取合成总cDNA,然后以cDNA为模板,使用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向,请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。(2)启动子通常具有物种及组织特异性,构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体,需要选择的启动子是(填写字母,单选)。A.人血细胞启动子B.水稻胚乳细胞启动子C.大肠杆菌启动子D.农杆菌启动子,(3)利用农杆菌转化水稻
50、受体细胞的过程中,需添加酚类物质,其目的是。(4)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径相比,选择途径获取rHSA的优势是。(5)为证明rHSA具有医用价值,须确认rHSA与的生物学功能一致。,答案(1)总RNA(或mRNA)(2)B(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞,有利于目的基因成功转化(4)水稻是真核生物,具有膜系统,能对初始rHSA多肽进行高效加工(5)HSA,解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)总cDNA是以mRNA为模板逆转录合成的,所以需要提取人的总RNA或mRNA;PCR扩增的原理是DNA双链复制,DNA双链复制时,两条子链的延伸方向相
