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1、植物组织培养 植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花等）、组织（如形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞），以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株，统称为植物组织培养。植物组织培养的过程可概括为：茎尖、胚及子房等器官做外植体可不经脱分化直接形成试管苗。植物组织培养技术是生物技术的重要组成部分，在生产实践及基因工程、遗传转化等研究中有重要应用前景。植物脱毒及离体快繁，花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，植物产品的工厂化生产等方面的
2、研究和应用，均必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法。通过本实验，要求同学掌握植物组织培养操作技术；了解外植体脱分化及再生的过程；理解植物细胞全能性。一、试材与用具1植物材料：花生、烟草、苹果、大白菜、玉米等。2实验室：准备室、接种室、培养室等。3仪器设备：高压灭菌锅（器）、光照培养箱、振荡培养箱、天秤、酸度计、超净工作台等。4器械及用具：镊子、手术刀、接种针、细菌过滤器、记号笔等。5玻动器皿：三角瓶、培养瓶、培养皿、量筒、容量瓶等。二、方法步骤（一）培养基的制备1母液的配制在植物组织培养中，不同的植物，不同的器官和组织，不同的研究目的，使用不同的培养基，培养基尽管千差万别，按其性质和含量来
3、分主要由以下几部分组成：无机营养，包括大量元素和微量元素；有机物质；铁盐；碳水化合物；天然复合物；激素；琼脂（固体培养基）；其他添加物。在培养基的配制中，对各组分的成分，常先要按其需用量扩大一定倍数，配制成母液（表21）。配制母液时应注意以下两个方面：（1）配制大量元素母液时，为了避免产生沉淀，各种化学物质必须充分溶解后才能混合，同时混合时要注意先后顺序，把钙离子（Ca2+）、锰离子（Mn2+）、钡离子（Ba2+）和硫酸根（SO42-）、磷酸根（PO43-）错开，以免形成硫酸钙、磷酸钙等沉淀，并且各种成分要慢慢混合，边混合边搅拌。（2）各类激素用量极微，其母液一般配制成0.11mg/ml。有些
4、激素配制母液时不溶于水，需经加热或用少量稀酸、稀碱及95%酒精溶解后再加水定容。常用激素类的溶解方法如下：萘乙酸（NAA）：先用热水或少量95%酒精溶解。吲哚丁酸（IBA）：先用少量95%酒精溶解后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）、（KIA）、（6-BA）：要先溶于1N盐酸。玉米素（ZT）、（ZEA）：先溶于95%酒精，再加热水。2,4D：需用1N NaOH溶解再定容。2培养基的配制、分装及灭菌根据培养基的成分及用量，吸取各种母液，称取蔗糖（一般用量3%），加水至所需体积，待蔗糖全部溶解后，用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度至pH5.8，加入琼脂粉（一般6.58g/L），加热使琼
5、脂完全熔化，蒸馏水补齐溶液体积，分装在三角瓶或培养瓶中，高压灭菌。不耐高温的培养基成分，需过滤灭菌。（二）外植体取材、消毒及接种1取材与消毒自大田取材或温室取材时应选取无病、无虫、生长健康的外植体。外植体表面消毒的一般程序为：外植体自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干。常用消毒剂的种类，使用浓度及消毒时间等见表22。2无菌操作（1）接种室消毒超净工作台面70%酒精试擦，打开紫外灯照射20分钟，进行无菌室及超净工作台杀菌。（2）材料的接种操作人员接种前必须剪除指甲，并用肥皂水洗手，接种前用70%酒精拭擦，接种时最好带口罩。接种时，必须在近火焰处打开培养容器的瓶口，并使瓶倾斜（瓶口低
6、，瓶底高），以免空气中的微生物落入瓶内。（三）无菌培养与观察接种后期材料放入培养室或培养箱内培养，温度一般为252，光照1016h，光强10002000勒克斯，有的材料需要暗培养。定期观察，继代培养（或转接培养）。三、植物组织培养程序实例（一）苹果茎尖培养1春季剪取5cm左右新梢茎尖，消毒后切取茎尖或带芽的茎段，接种在MS+2mg/L BA的培养基上培养诱导芽伸长。2把伸长的芽切段接种到MS+1mg/L BA+0.5mg/L K2N+2mg/L IAA的培养基上培养，获得丛生芽。3切取约2cm长的芽，浸入100mg/L IBA液体培养基中1530min，接种在1/2MS（蔗糖20g/L）的培养
7、基中，培养20d获得生根试管苗。4生根苗移出进行砂培23周，移入土壤中生长。（二）大白菜侧芽培养切取24mm长的腋芽，70%酒精表面消毒，10%漂白粉消毒2030min，接种于MS+5mg/L BA+2mg/L IAA培养，侧芽伸长后转入MS+1mg/L BA+2mg/L NAA的培养基中诱导生根，形成试管苗。摘要 植物组织培养中经常出现不同程度的污染问题，造成很大的损失，因此控制污染是植物组织培养苗工厂化生产中重要的技术环节。本文作者从一般的污染的控制、内源性污染的控制、继代培养中污染防治、减少培养基中的有机成分等方面，讨论了怎样减少组培中出现的污染问题，如：对于一般的污染来说，主要从操作环
8、境、操作人员、仪器；对于内源性污染主要是从外植体预处理到外植体灭菌方法；对于继代培养污染的控制主要是从对无菌外植体进行检验和反复进行茎尖培养或分生组织培养；至于对培养基有机成分的减少措施主要是减去培养基中的VB1、VB6或除去培养基中的蔗糖这几方面加以论述。关键词植物组织培养，污染，防治植物组培苗工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养各方面的技术日渐完善。但在组织培养中常常出现不同程度的污染。据了解，很多学者在初代培养这一阶段，很难得到无菌苗，或者虽然在初代培养得到了无菌苗，但在继代培养时往往出现大量污染甚至全部污染。在市场竞争中，如何降低成本是提高经济效益的首要问题，组织培养中污染率的增加势
9、必然引起组培苗成本的提高，经济损失大。因此，组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。在植物组织培养过程中，存在两种类型的污染：一类是通常所说的污染，即外植体消毒不彻底，无菌操作和培养过程中，如：培养基、接种工具、接种室消毒不严格或操作不规范而导致的污染；另一类是内源菌污染，内源菌包括真菌和细菌，内源污染一般是指内源细菌所致的污染。具体预防和解决方法如下：1 通常污染的控制1.1症状与来源在培养过程中，培养材料附近经常出现黏液或混浊的水迹，并有发酵状泡沫。这大多是细菌性污染，主要是由于使用了未消毒好的工具及操作者呼吸时排出的细菌所引起的，或是操作人员的手接触了材料或器皿边缘所致；有
10、时培养基上还会出现黄、白、黑等不同颜色的霉菌，这是真菌性污染，主要是由于接种室空气污染造成的。1.2操作污染和环境污染操作污染和环境污染指真菌污染和细菌污染。真菌污染主要来源于环境，细菌污染主要来源于接种材料及工具。此类污染可通过如下措施加以克服：1.2.1改善环境条件每次接种前应对接种室的地面进行清洁卫生工作，并用75%的酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外线灯在黑暗中照射2030分钟。接种前工作台面要用新洁尔灭或75%酒精擦洗,使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。但它应置放在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使用寿命。培养室的相对湿度应控制在70%左右，相对湿度太高时可
11、以用抽湿机除湿。在接种结束时，应进行地面清洁卫生工作，即先打扫一遍，再用湿布擦过，并定期用甲醛熏蒸接种室。1.2.2无菌操作和无菌操作技术工作人员使用的工作服、帽子、口罩等，要经常保持干净，并定期进行消毒。在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液擦洗，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10分钟，后用75%的酒精擦手，并用75%的酒精擦拭母种瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。同时要求工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌，它外被荚膜，耐高温，一般消毒剂难以杀死。它可随培养材料、用具等传播；也可出现在
12、培养基表面，或呈滴形云雾状存在培养基内，若出现时应严格灭菌，清洗和消毒用具，并更换消毒酒精。操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。因为有很多组织培养的失败，从材料、培养基条件等方面检查均无问题，只是由于操作技术不熟练，如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌，再同时接种的环境又不是绝对无菌的。 1.2.3严查接种材料淘汰被真菌或细菌污染过的接种材。1.2.4经常检查消毒锅的灭菌质量消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅。因冷热空气作用的负压效应，使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌好的培养瓶内引起真菌污染，为避免该现象的发生，消毒后培养瓶应留
13、在锅里，等冷却后才出锅。如果出现培养基造成的污染，就要及时地检查灭菌锅的性能或其他的问题。1.2.5检查培养容器是否存在问题培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。同时，培养瓶在使用之前要洗净（包括瓶内瓶外），灭好菌的培养瓶不要放在空气中太久，一般出锅后12天内接完种最好，以减少培养瓶表面的微生物引起的污染。2内源性污染的控制2.1 内源性污染的含义在植物组织培养中，由于材料内部的内生菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料进入培养过程，引起的污染称为内生性污染或内源性污染。2.2内源性污染的种类从已有报道看，被鉴定的种类主要有：黄单胞菌属、芽
14、孢杆菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、棒状杆菌属、欧文氏菌属等。真菌主要有霉菌。目前在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过129种（隶属于54个属）对于一种植物而言，从中分离到的内生真菌和内生细菌通常为数种至十种，有的还到百种之多，其主要出现在热带植物组织中。2.3内源性污染的分布内源性污染主要发生在那些生长在高温多雨的热带、亚热带和多年生木本植物，尤其是在污染较严重的地区，如工业区，人口众多的城市，公路边等。2.4内源性污染的症状和危害性在初代培养中，表面细菌引起的污染通常在23天就能在外植体周围或培养基表面形成明显的如水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落。而在外植体
15、培养后35天内并未发现细菌污染，以后则不继出现明显的或不明显的细菌菌落，就可能是由内生细菌引起的污染。在某些植物初代培养或前几代的继代培养中存在的污染，并不形成明显的菌落而只在培养基内部形成“丝状物”，“晕状物”，不易被肉眼发现的，如不仔细观察很容易忽视，随着继代培养次数的增加，菌量不断的积累，就会在培养基上表现出来。对于这种情况，我们可以利用背光检查法去观察发现它。内生细菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败，增殖效率降低，培养物生长减慢，玻璃化苗增多等。在后期导致试管苗移栽困难或死亡，有时污染也会引起培养物的遗传变异。2.5内源性污染的防止措施2.5.1外植体的消毒2.5.1.1预栽管理一
16、般来说，温室内盆栽的植株比室外栽培的植株含菌少，为了能更好的降低污染率，我们要把室外栽培变为室内盆栽。要求：盆栽用土应使用不含有机质及经消毒的清洁土壤，尤其是要采集地下材料时，须用经过消毒蛭石等作栽培基质；施用无机肥，并对植物喷洒杀虫剂和杀菌剂。不便移栽的，可套塑料袋，待长出新枝条后，再采样接种。2.5.1.2外植体预处理2.5.1.2.1促发新枝将田间采集的枝条用水冲洗干净后插入无糖的培养液或自来水中，使其发枝，后以这种新抽的嫩枝作为外植体，可大大减少内源菌的污染。2.5.1.2.2 黄化处理在无菌条件下，对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，也可减少污染。这方法曾用于成年
17、栗树的枝条和仙客来实生苗，减少了内生细菌的污染。2.5.1.2.3热击处理如将美丽百合的鳞茎外植体放入试管中进行43聂氏度热击处理，罗伯利槭的休眠芽进行42.5聂氏度或45聂氏度热击处理；草莓茎尖在30聂氏度处理可得脱毒苗。2.5.1.2.4用抗生素进行处理庆大霉素和链霉素，属于氨基糖苷类型，它们与细菌中的30S核蛋白体亚单位结合，抑制细菌的酸苷油酯合成，通过阻断其正常代谢途径使微生物致死。如相思树的茎段灭菌时，用皂液刷洗和75%酒精杀菌后，转入不同的抗生素溶液中，在摇床上振荡过夜，再用75%的酒精和0.1%升汞分别杀菌1分钟和15分钟，灭菌效果（如下表）其中以抑制剂ANB1和ANB2的抑制效
18、果较好，未污染的分别为63.3%和76.7%；成活率分别为60.0%和50.0%。不同抗生素预处理对相思树茎段的影响 处理接种茎段数未污染的成活的茎段数比例（%）茎段数比例（%） ANB1301963.318 60.0 ANB2302376.715 50.0 头孢拉定30000 0.0 林肯霉素30723.35 16.7 庆大霉素301550.08 26.7 对照CK 30 2 6.7 1 3.32.5.1.3改进灭菌方法2.5.1.3.1真空减压灭菌利用真空减压抽走植物组织中的空气，使消毒剂容易侵入，从而增强杀菌效果。经对万年青茎段的实验可知道：减压灭菌的效果明显优于常规灭菌（如下表），未污
19、染率从常规的6.7%升到60.0%，成活率从常规的3.3%升到43.3%。常规灭菌与真空减压来灭菌对万年青茎段防止效果比较处理接种茎段数未污染的成活的茎段数比例（%）茎段数比例（%）常规灭菌3026.713.3减压灭菌302860.01343.32.5.1.3.2磁力搅拌、超声波振动法为减少在外植体表面形成的气泡，在浸泡时还可采用磁力搅拌和超声波振动的方法。如对月季、苹果的枝条，用0.1升汞磁力搅拌1520分钟，再用无菌水磁搅拌清洗，污染率有所下降。2.5.1.3.3灼烧灭菌利用火烧的方法杀死外植体表面的所有微生物，以不伤害所要使用的组织或细胞为度。如将马蹄莲的根在95%的酒精中浸泡1分子钟后
20、，短时间内灼烧2次，比常规消毒的污染率降低60%。这种方法已用在绿色荚果、蒜的小鳞茎和银白杨芽的消毒。2.5.1.3.4酸化培养基除了欧文氏菌属外，大多数细菌在介质PH小于4.5时不能生长。在紫苑属、鸢尾属、蔷薇属植物组织中，将培养基的PH5.8降到3.94.3，可防止大量的细菌污染。2.5.1.3.5 其他多次消毒如先用皂液对番木瓜侧芽浸泡2030分钟，再用0.1%高锰酸钾溶液处理5分钟，然后进行消毒处理，然后用4%次氯酸钠加0.1%升汞消毒，最后用无菌水洗，污染率降低为50%左右；使用混合消毒液是用几种消毒液(如多菌灵、抗坏血酸、柠檬酸、氯霉素等混合)对外植体时行处理，以降低污染率；在培养
21、基中加入其他抑菌剂（如50%多菌灵、70%甲基托布津和25%甲霜灵）抑菌率也非常高。2.5.2继代培养中污染的控制初代培养获得的无菌材料在后期或继代培养也可能出现污染，这一方面是由于操作不慎的原因，另即是由于初代培养中使用了营养相对简单的培养基有可能使污染不易表现出来，有时继代材料在培养室则可能被螨传播的真菌污染。这类污染可以从以下2个方面进行防止。(1)扩大繁殖时应有合理程序。在获得的无菌培养物之后，应将其中一部分作为“原种”保存起来，分批繁殖和复检后再大规模生产。（2）可通过在培养基中加入抗菌剂来防止。多菌灵用于金线莲组织培养的抑菌促生长，培养物不受微生物污染，灭菌率为98%以上，无白化苗
22、，生长健壮，不过这种方法不能广泛使用，因为有些植物在抑菌素会受到毒害，如叶片变小、变黄和不能分化等。还有使用时要调到适合的浓度。对植物中的内生细菌，由于它潜伏得较深，表面消毒方法无法将其消灭。有时在外植体的初级培养中，包括前几代的继代培养，往往在培养基上不易被发现，随着继代次数的增加，菌量慢慢累积发展，才在培养基上显现出来。可通过在培养基中添加抗菌素，降低PH值等措施防止和减少细菌等内生菌的污染。植物材料中的内生菌，也可采用反复茎尖培养或分生组织培养的方法来脱除。因致病菌在植物体内的分布不均，且是通过维管束传播的，故茎尖分生组织是不带菌的。因此，通过反复的茎尖培养和分生组织培养，既可脱内生菌又
23、可脱毒。2.5.3减少培养基中的有机成分培养基中有机成分的存在是污染产生的重要原因,去除有机物是减少污染的一条途径。在阿月浑子的组织培养中，除去培养基中的VB1、VB6、烟酸等（保留肌醇）有机成分，经23代培养后，能抑制细菌生长，对丛生芽生长增殖没有影响。原因是这些都是某些细菌生长的必须物质，去除这些有机成分后，细菌无法生长发育而慢慢死亡或减少。经试验，在罗汉果生根培养中，除去糖成分，在罗汉果苗生根时，可适当加强光照，同时在接种时，要适当地留一些小叶片，但不能让叶片接触到培养基，生根苗的生长都良好。由日本的古在丰树教授首创的无糖组织快繁技术则全部除去培养基中的有机成分，输入可控制量的CO2气体
24、作为碳源，并通过控制环境因子，促进植株光合作用速率，使之由异养型转变成自养型，因而植物长势良好，污染率明显降低。3 总结在植物组织培养中，一般的污染较容易控制，要达到接种的无菌环境条件，无菌操作要求和无菌操作水平。而内源菌则较难控制，要求全部杀死植物表面和组织中的微生物，一般的消毒方法是不能完成的。通过先对外植体植物进行预栽管理、外植体的预处理，并在这基础上，改进消毒方法，（如真空减压法、酸化培养基、灼烧法等），也可除去培养基中的有机成分，这些措施都能降低由内源菌引起的污染。当然，在植物组织培养中，控制污染的方法是可灵活多变的，只要能减少污染，不会发生培养物的遗传变异，实现工厂化快繁，降低成本
25、，能在市场竞争中占有一席之地即可。参考文献1周俊辉 周厚高 刘花 全植物组织培养中内生细菌污染问题.2003.23(1);41472 柴向华 李军 张秀珊 詹海洋 王细燕 植物组织培养中污染的控制. 2 003.23(6)40433周俊辉 刘花全 罗慧君 谢海佳 黄树行 玛丽安万年青茎段培养的污染防止2002 15(4);43484林盛 马崇烈 胡东琼 组织培养中污染的控制 1994 (2)8788 5周俊辉 植物组织快繁技术中存在的问题和对策1999 12（4）64706朱广廉 植物组织培养中的外植体灭菌1996 32（6）444446褐化解决方法1. 防止褐化的方法很多，试试加点PVP、活
26、性炭，硫代硫酸钠，可以直接高温灭菌。2.维生素C有一定的抗褐变功能，常用浓度5mg/L；维生素B1也可防止褐变，常用量0.41mg/L；活性炭有吸附作用，可吸附有害物质，也有一定的防褐变作用。3.A novel technique to overcome browning in tissue culture. Plant Cell Report 1991. 10:358-360里面介绍到用石蜡来遏制褐化。用石蜡封闭伤口，褐化现象明显减少。4.低盐的培养基也有点效果。5.在配母液时，微量中不要加硫酸铜，氯化钙减半，酚类氧化酶的辅酶是铜离子为主，少量是其它的2价离子。我做过红豆杉，这个方法很好。另
27、外有一些体会告诉你。1.继代时，材料在空气中的暴露时间一定要短，接种到瓶子里后在洒精灯上烤烤，烧掉里面的一些氧气，马上盖盖。酚类氧化最怕的就是短时间内大量反应，盖上盖后小规模的氧化植物本身可以低御。2.第一次接种时，嫩材料在还原剂如Vc等里面浸泡一段时间3.添加剂里，活性碳效果最好。2. 防治玻璃化3. 控制玻璃化要从培养的环境条件和生理生化方面入手，具体措施如下： 利用固体培养，增加琼脂浓度，降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏。提高琼脂纯度，也可降低玻璃化。 适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，减少培养基中植物材料可获得的水分，造成水分胁迫。 降低培养容器内部环境的
28、相对湿度。 适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度。 控制温度适当低温处理，避免过高的培养温度在昼夜变温交替的情况下比恒温效果好。 增加自然光照。试验发现，玻璃苗放于自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，因自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。 增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量，降低N和Cl元素比例，特别降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量。 改善培养容器的通风换气条件，如用棉塞或通气好的封口膜封口。 青霉素G钾（2mg/L6mg/L）能有效防治菊花试管苗的玻璃化（陈龙清等），青霉素（40万单位/升）可降低芥菜试管苗的玻璃化（陈国菊等）。 培养基中加入间苯三酚或根皮苷。
