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1、1,条件增殖腺病毒在肿瘤治疗中的策略,条件增殖腺病毒在肿瘤治疗中的策略,微生物教研室李晓霞,2,内容,基因治疗分类主要病毒载体系统腺病毒载体在肿瘤治疗中的策略条件增殖腺病毒现状及策略,基因治疗及分类,4,Gene-targeted therapy，以基因为靶点的治疗，将遗传物质导入人体组织或细胞所进行的疾病的治疗,基因治疗,5,历史与回顾,1980年有人提出用磷酸钙介导基因转移来治疗地中海贫血。离体基因治疗 ex vivo80年代初建立逆转录病毒体系为基因治疗提供高效率的转移载体。1989年5月22日Rosenberg首次将外源基因-新霉素抗性基因用逆转录病毒导入肿瘤浸润淋巴细胞中。,6,历史
2、与回顾,Anderson于1990年9月4日第一次用于人类疾病的基因治疗，两例由于腺苷脱氨酶缺失导致的免疫缺陷的女孩经逆转录病毒载体将该酶基因导入骨髓而获救，并且存活至今。2004 年1月，深圳赛百诺基因技术有限公司将世界上第一个基因治疗产品重组人p53 抗癌注射液(商品名：今又生)正式推向市场，这是全球基因治疗产业化发展的里程碑,7,基因治疗分类,根据给药途径和方法离体基因治疗 ex vivo原位基因治疗 in situ体内基因治疗 in vivo,8,基因治疗分类,离体基因治疗 ex vivo将目的基因在体外导入自体或异体来源的肿瘤细胞或其它细胞，再将这些修饰过的靶细胞转入体内。原位基因治
3、疗 in situ将目的基因载体直接注射或导入体内的肿瘤组织，进行局部治疗，这也是最主要的方法。体内基因治疗 in vivo将目的基因载体注射到血液系统进行全身治疗。,9,基因治疗分类,根据基因导入的方法裸露DNA直接注射注射gene gun脂质体共转化体外细胞转化受体介导的基因导入病毒载体,主要病毒载体系统,11,常用的病毒载体的特点,12,因该病毒最初来自腺体，故命名为腺病毒(Adenovirus)。根据宿主可分鸟腺病毒属和哺乳类腺病毒。目前，把人腺病毒的46个血清型分为A-F 6个组：A-E组：各型病毒均能在人的组织细胞(如肾细胞)常规培养中增殖，称为普通腺病毒；F组（40和41型）：是
4、从粪便中发现，用常规细胞培养不能增殖的腺病毒，称为肠道腺病毒。,腺病毒,13,基因治疗中常用的基因载体 C亚群:2型及5型腺病毒 增殖能力非常强，滴度通常可以达到109pfu 遗传背景和生化结构清楚,腺病毒,球形，无包膜，直径70-80nm。,二十面体病毒壳体,16,腺病毒,壳体含有三种主要的蛋白：六邻体（II），五邻体基底（III）和纤突（IV），还有多种其他的辅助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2,17,纤突结构域CAR(coxsackie adenovirus receptor)五邻体基质中精氨酸甘氨酸天冬氨酸基序（Arg-Gly-Asp,RGD）细胞整合素,18,腺病毒,线性
5、双链DNA,基因组36kb早期和后期转录单元前者有E1a、E1b、E2、E3、E4和两个延迟型早期单元和a2，编码病毒的调节蛋白后者有L1、L2、L3、L4、L5 五个区，编码病毒的结构蛋白,19,腺病毒载体构建,在人腺病毒C亚群的Ad2 和Ad5 基础上构建E1区为病毒复制必需区，缺失则成为复制缺陷型载体E3区是病毒复制非必需区，用于外源基因的插入,20,腺病毒载体的优点,腺病毒粒子相对稳定,病毒基因组重排频率低,外源基因片段插入片段在病毒复制几个周期后仍可保持不变,易于用重组DNA技术操作;安全性较好,腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中,目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达,整合突变致癌
6、可能性小,基因毒性低;腺病毒基因组较大(36 kb),绝大多数基因组(约35 kb)均能被外源基因取代,插入大片段外源性基因的潜力大;有较大的宿主范围,可以感染肝细胞、血管内皮细胞等多种人体细胞,对于受体细胞是否处于分裂期要求不严格;腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中,并有效表达成活性蛋白。,21,第一代腺病毒载体,去除了El/E3基因表达盒,可以插入长达615kb的外源DNA。去除E1区还阻止了依赖E1区和E2区功能蛋白的转录与随后病毒DNA的复制及病毒外壳蛋白的产生。E1区缺失的腺病毒在能够反式提供E1区基因蛋白的细胞中得到增殖。,22,第二代腺病毒载体,在E1、E3缺失的基础上进
7、一步去除了E2区和(或)E4区,减弱病毒蛋白的表达用于鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症的I期临床实验。,23,第三代腺病毒载体,通过对无感染能力的腺病毒颗粒的观察,发现无感染能力腺病毒颗粒的基因组都含有腺病毒基因组左端的一段序列即包装信号。因此设想保留两端TR(Terminal Repeats)及包装信号共约500bp 的顺式作用元件,去除腺病毒基因组中全部编码序列(反式作用元件),其它功能由辅助病毒提供,这样的腺病毒载体就是第三代腺病毒载体即所谓空壳载体（gutless adenovirus）。,腺病毒载体在肿瘤治疗中的策略条件增殖腺病毒,25,条件增殖腺病毒,通过基因工程的方法使病毒特异性地在肿
8、瘤细胞中复制来杀死并裂解肿瘤细胞，从中释放出来的病毒又可以进一步感染周围的肿瘤细胞，这类病毒被称为条件增殖腺病毒（conditionally replicative adenovirus,CRADs）或溶瘤腺病毒（Oncolytic adenovirus）。,26,CRADs 的分类,改变病毒的基因使其可以在肿瘤细胞中复制，而在正常细胞中复制能力降低，称为I型CRADs。E1B基因dl1520(美国ONYX公司)5型腺病毒，缺失了E1B区编码55kd蛋白的序列，该蛋白可通过结合细胞内的p53使其功能受到阻滞。头颈部肿瘤和卵巢癌的治疗进入一期和二期临床试验。E1A 基因与细胞周期调控蛋白Rb 结
9、合，克服其对细胞周期的抑制作用，使细胞周期由G1 期过渡到S 期，病毒大量复制腺病毒突变株Ad5-24 和dl922-947的E1A 基因在第2 个保守区（CR2）缺失24个碱基，,27,表 1型CRAd的种类,28,利用肿瘤特异性启动子（tumor specific promoter,TSP）控制病毒复制相关基因在肿瘤细胞中选择性表达，称为型CRAD。这类病毒利用肿瘤特异性启动子，使其控制腺病毒复制必需基因（E1A及E1B），使这些必需基因只在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达，从而实现肿瘤特异性增殖目的。,29,表 型CRAd中的TSP,30,双启动子分别调控病毒复制所必需的不同基因。以
10、PSA启动子调控Ad5的E1A，以hK2（human kallikrein 2）的启动子来调控E1B的表达，实现对前列腺癌的双重调控 杂合启动子由hTERT启动子和CMV最小启动子组成的杂合启动子调控腺病毒E1a区基因表达,31,提高治疗效果的策略,通过改变腺病毒的嗜性增强转导靶向性构建双衔接分子该分子可同时与病毒外壳和宿主细胞结合，从而增强腺病毒载体的转导靶向性病毒抗体：腺病毒纤突、五邻体基质和六邻体壳粒配体：如叶酸酯、基本的成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor,FGF2）抗体：如表皮生长因子受体的抗体（anti-epidermal growth fa
11、ctor receptor,anti-EGFR）、表皮细胞粘附素抗体（anti-epithelial cellular adhesion molecule,anti-EpCAM）,32,基因工程方法改变腺病毒的嗜性腺病毒5型，暴露于纤突蛋白之外的HI 环结构备受重视，它可以允许更多得氨基酸片段的插入，约100个，如RGD-4C肽嵌合的Ad5和Ad3纤突蛋白结构域能高效地转导CAR低表达的肿瘤细胞；Ad5/3嵌合衣壳能在一定程度上避免体内早已存在的Ad5抗体对腺病毒的中和作用,33,提高治疗效果的策略,肿瘤特异性启动子在转录水平控制外源基因在特定的组织细胞中表达CRAds中插入外源基因，将CRA
12、ds的溶瘤治疗与基因治疗相结合，使其既有对肿瘤的直接杀伤作用，又可以把外源性的治疗基因稳定地转入肿瘤细胞内并大量、持续的表达，从而达到溶瘤-基因治疗的双重目的，这种病毒又被称为“武装后的条件增殖腺病毒”（armed CRAds）。,34,插入的外源基因 自杀基因如胸苷激酶（TK）基因、胞嘧啶脱氨酶（CD）基因 免疫调节因子TNF、IL-2及肿瘤抑制基因P53 报告基因编码荧光蛋白或其他放射性标记蛋白,35,目前面临的问题及展望,由于人体免疫系统的干涉，静脉注射的病毒往往被免疫系统排除殆尽；腺病毒在实体瘤中的扩散受到限制，这与肿瘤大小、肿瘤中正常细胞比例偏高（某些肿瘤中达50%）、肿瘤细胞中病毒受体表达量低等因素密切相关；肿瘤细胞具有异质性，病毒对于某些肿瘤细胞的杀伤效果好于其它细胞。安全性包括溶瘤病毒的毒性、基因修饰后的安全性等，病毒基因治疗中存在野生病毒的回复突变以及病毒在人群之间传播的危险。,36,对已有的策略进行优化 采用多种机制联合进行靶向 病毒与化学方法、放射方法结合治疗肿瘤,37,思考题,腺病毒作为载体的优势及提高腺病毒治疗肿瘤的策略有哪些？,
