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1、超高压提取甘草酸的工艺研究工艺咨询：E-mail： 13283712413 由张峻松，张常记，潘存宽，王修铭，毛多斌，杨公明等负责的：郑州轻工业学院博士基金项目 .经郑州轻工业学院食品与生物工程学院，红云红河集团新疆卷烟厂，新疆奎屯对常温下超高压提取甘草中甘草酸的工艺进行探讨。以甘草酸提取率为评价指标，考察提取时间、乙醇体积分数、液固比和超高压力对甘草酸提取率的影响。通过单因素试验和响应面分析法确定最佳工艺条件：提取时间15min，乙醇体积分数49.50%，液固比13:1，提取压力382MPa，甘草酸提取率的最大预测值为14.61%。按最佳工艺验证试验5 次，甘草酸平均提取率为14.67%，相
2、对标准偏差(RSD)为0.29%(n=5)。甘草(Glycyrrhiza)，又名甜草根、粉草根，系豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza)植物，其根在我国已有四千多年的药用史。现代研究证实， 甘草酸(glycyrrhizic acid，GA)是甘草中最有效的成分之一，具有抗炎、抗病毒、保肝解毒及增强免疫力等功能1。尤其是近年来甘草酸对艾滋病病毒和SARS 病毒有特殊功效的报道2 -3，受到越来越多国内外学者的重视。目前，有关甘草酸提取方法的报道4-9比较多，但这些方法都不同程度地存在提取时间长、操作量大、杂质溶出率高、溶剂倍量多、能耗高等缺点。本实验在借鉴超高压在食品中运
3、用的基础上，对超高压提取甘草中甘草酸的工艺进行研究。超高压萃取技术(ultra highpressure extraction，UPE)8-13就是指超高压技术在天然产物萃取中的应用技术。是将原料及萃取剂以一定形式包装以后，放入密封的、高压容器中，在常温下施加1001000MPa 的压力保压一段时间后卸压，取出样品就完成了整个萃取过程。该技术的特点是常温超高压浸取，有效成分基本无损失，活性高，提取时间短，提取率高，可以使用各种溶剂，且对分离、纯化有利，无污染，经济性和安全性好。本实验研究超高压提取过程中各主要因素对甘草酸提取率的影响，通过单因素和响应面试验14-15得出最优提取工艺条件，以期为
4、深化甘草酸的提取提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料、试剂与仪器甘草切片 河南省药材药业有限公司。甘草酸对照品替斯艾么中药研究所；无水乙醇和硫酸等试剂均为分析纯。UHP 900 2 超高压装置(超高压处理室的有效体积为1L) 内蒙古包头文天科技有限公司；UV-2100 型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；菲恰尔TDL-5A 型台式离心机上海菲恰尔分析仪器有限公司；DHG-9145A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；METTLER 4E200 型电子分析天平 上海沛欧分析仪器有限公司。1.2 原料预处理将甘草切片粉碎成粗粉，称取10g 甘草粗粉，加入一定量溶剂，在一定
5、压力下保压一定时间后迅速(2s)卸压，离心提取液，滤液浓缩至原体积的1 / 5 ，浓缩液冷却至室温后加入1/2 体积的95% 乙醇，静置过夜，过滤，滤液边搅拌边滴加3mol/ml 浓硫酸至pH12，放冰箱静置后，4000r/min 离心10min，沉淀冻干成粉，得甘草酸粗品。1.3 甘草酸含量的测定绘制标准曲线：准确称取25mg 甘草酸对照品，用50% 的乙醇定容至25ml，混匀后分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml 于50ml 容量瓶中，再用50% 乙醇定容。以 50% 乙醇做空白，在254.0nm 波长处测定吸光度，作标准曲线，以吸光度(A)为横坐标，浓度(C，mg/ml)为
6、纵坐标，得回归方程：C=10.537A 0.0066，r=0.9996 (n=5)。该标准曲线在0.00060.1008mg/ml 范围内呈线性关系。甘草酸含量的测定：准确移取离心后提取液1ml 转移到10ml 容量瓶中，用50% 乙醇定容，准确移取上述溶液1ml 于50ml 容量瓶中，用50% 乙醇定容，静置5min后，以空白为参照，于254.0nm 处测定其吸光度。根据标准曲线计算甘草酸提取率。1.4 单因素影响试验主要考察提取时间、提取溶剂、液固比、以及提取压力等因素对甘草酸提取率的影响。1.5 响应面分析法试验设计在单因素试验的基础上，选择对响应值(甘草酸的提取率) 有显著影响的三个因
7、素进行响应面试验。采用Design-Expert 7.0.2 对试验数据进行回归分析9。每一自变量的低、中、高实验水平分别以 1 、0 、1 进行编码，该模型通过最小二乘法拟合二次多项方程。2 结果与分析2.1 单因素分析2.1.1 提取时间对甘草酸提取率的影响在提取温度为室温，提取溶剂30% 乙醇，液固10:1(ml/g)，提取压力300MPa 的条件下，考察了不同提取时间对甘草中甘草酸提取率的影响，实验结果如图1所示。由图1 可知，提取时间对甘草酸提取率的影响不大，因此本研究选择提取时间为15min。 2.1.2 乙醇体积分数对甘草酸提取率的影响在提取温度为室温，提取时间为15min，提取
8、压力300MPa，液固比选取10:1(ml/g)条件下，考察了乙醇体积分数对甘草酸提取效果的影响，实验结果如图2 所示。从图2 可以看出，乙醇体积分数为50% 时，甘草酸提取率最高。2.1.3 提取压力对甘草酸提取效果的影响在提取温度为室温，提取时间15min，乙醇体积分数为50%，液固比选取10:1(ml/g)的条件下，考察了提取压力对甘草酸提取率的影响，实验结果如图3 所示。由图3 可知提取压力为400MPa 时，甘草酸提取率最高。2.1.4 液固比对甘草酸提取效果的影响在提取温度为室温，提取时间15min，乙醇体积分数50%，提取压力400MPa 的条件下，考察了不同液固比对提取效果的影
9、响，结果如图4 所示。从图4 可以看出，液固比选取12:1(ml/g)时，甘草酸提取率最高。 2.2 响应面优化试验及结果分析2.2.1 响应面分析试验在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken 的中心组合设计原理，以乙醇体积分数、液固比、提取压力三个因素为自变量( 分别以A、B、C 为代表) ，以甘草酸提取率(以Y 为代表)为响应值设计三因素三水平共17 个试验点的响应面分析试验14-15，其因素水平选取如表1所示，试验方案与结果如表2 所示。利用Design-Expert 软件对表2 数据进行二次多元回归拟合，得到甘草酸提取率的二次多项回归方程：Y=14.61+0.015A+0.08
10、8B 0.048C 0.063AB 0.043AC 0.012BC 0.57A2 0.49B2 0.54C2对上述回归模型进行方差分析。回归模型方差分析结果见表3，结果表明，模型显著(P=0.0002)，回归模型的决定系数为0.9697，说明该模型能够解释97.0% 的变化，因此，可用此模型对甘草酸提取率进行分析和预测。表1 响应面设计因素与水平 表3 回归模型方差分析结果 表2 响应面分析方案与试验结果 图5 乙醇体积分数和液固比交互作用 图6乙醇体积分数和液固比交 图7 液固比和提取压强交互作用对甘对甘草酸提取率的影响 草酸提取率的影响2.2.2 甘草酸提取率响应面分析优化利用Design
11、-Expert 软件对表2 数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面及其等高线乙醇体积分数和液固比交互作用对甘草酸提取率的影响见图5，乙醇体积分数和提取压力交互作用对甘草酸提取率的影响见图6，液固比和提取压力交互作用对甘草酸提取率的影响见图7 。从图5 等高线图可以看出，提取压力为400MPa 时，乙醇体积分数和液固比的交互作用显著。因为等高线的形状反映交互效应的强弱大小，近圆形表示两因素交互作用显著。在乙醇体积分数为30% 时，得到较高甘草酸提取率需要液固比15:1；乙醇体积分数提高到50%时，液固比只需要12: 1 ，且甘草酸提取率最高。这表明，在本实验水平范围内，适当提高乙
12、醇体积分数有利于甘草酸的溶出并可减少提取溶剂。从图6 可看出，液固比为12:1 时，乙醇体积分数和提取压力对甘草酸提取率的交互作用显著。在乙醇体积分数为30% 时，得到较高甘草酸提取率需要提取压强500MPa；乙醇体积分数提高到50% 时，提取压强只需要400MPa，且甘草酸提取率最高。这表明，在本实验水平范围内，适当提高乙醇体积分数有利于甘草酸的溶出并可减少提取压强。从图7 可看出，乙醇体积分数为50% 时，液固比和提取压力比对甘草酸提取率的交互作用显著。随着液固比的增加，达到甘草酸最大提取率所需要的提取压力降低。在一定的液固比范围内，随着液固比的增大，甘草酸提取率增加；液固比超过12:1
13、时，甘草酸提取率反而下降。2.3 最佳工艺验证实验 表4 验证实验通过甘草酸提取率的二次多项数学模型解逆矩阵，得出在乙醇体积分数49.50%、液固比13.07:1、提取压力382MPa 的工艺条件下，甘草酸最大提取率预测值为14.61%。考虑到实验的可操作性，最佳工艺条件修正为：乙醇体积分数49. 5 0%、液固比13:1、提取压力382MPa。为考察上述优化工艺条件的稳定性，取甘草粉10g，在最佳提取条件下进行5 次重复实验，甘草酸的提取率见表4。平均提取率为14.67%，相对标准偏差为0.29%(n=3)，说明该工艺稳定可靠。甘草酸的提取率优于其他常规方法2.4 对比实验表5超高压和热回流
14、提取方法的比较采用热回流和超高压提取方法提取甘草中甘草酸，甘草酸提取率如表5 所示。由表5 可知超高压提取时间最短，是常规热回流提取时间的0.83%，而提取率比热回流高63.9%。3 结 论3.1 本研究通过单因素和响应面分析法对甘草酸的提取工艺参数进行了优化，确定超高压提取甘草酸和总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数50%，液固比13:1，提取压力400MPa，保压时间15min，提取温度20，在此条件下，甘草酸的提取率分别为14.61%。3.2 超高压提取技术是提取甘草中甘草酸的高效方法，具有提取率高、周期短、无污染、杂质溶出少。经超高压处理后，蛋白质、淀粉等已经变性，方便了溶液的分离、纯化。根据以上实验，400Mpa工业化设备目前在国内有难度，为满足工业生产要求，采用200Mpa经小试30min液固比10:1 时，也能得到400Mpa15min的实验效果。目前国内超高压液态应用中心最新设计：200Mpa500L超高压液态应用系统，设备成本价格低，（135万）具备企业应用接受能力。按照设计要求400Mpa500L的工业化设备，目前有难度不说，就是能够制造，其价格也将高许多倍。友情建议可应用200Mpa500L的超高压液态工业系统。江苏无锡超高压液态技术应用中心创新创意部 联系人：雷钬杰132701358132010年11月8日
