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1、,天津医科大学生化教研室 解 用 虹,基因表达调控,教学要点,1.掌握基因和基因表达的概念，熟悉基因表达调控是在多级水平上进行的复杂事件以及转录起始是基因表达调控的关键环节。2.熟悉基因表达的方式，原理和重要的生物学意义。3.掌握操纵子是原核生物基因表达的基本方式和特点。掌握乳糖操纵子的组成，负性与正性调节机制，理解基因调控对环境的适应。了解乳糖操纵子在基因工程中的可能应用和机理。4.熟悉真核生物基因转录调节的特点，熟悉顺式作用元件和反式作用因子的概念，相互作用的机理与复杂性。,一.基因和基因组,一 基因 1.基因的概念 2.基因的结构 3.真核细胞基因的特点二 基因组 1.基因组 2.人类基
2、因组计划,1.基因的概念,1.遗传学的基因是遗传的基本单 位或单元,是编码一个功能分子(RNA或多肽)的信息单位。2.分子生物学的基因是负载特定 遗传信息的DNA片段。,遗传学基因概念的提出,1865年孟德尔（Gregor Mendel，1822 1884)通过豌豆杂交实验发现生物体的遗传性状是由“遗传因子”决定的。1909年Johnson将Mendel提出的遗传因子命名为基因,遗传学基因概念的提出,20世纪20年代摩尔根（Thomas Hunt Morgen）通过果蝇实验，确定基因存在于染色体,2.基因的结构,1.结构基因（可转录序列）5非编码序列 前导序列 外显子-内含子2.调节基因（调节
3、序列）启动子 增强子 沉默子,3.真核细胞基因结构特点,1.核基因组结构庞大 哺乳类动物（人）基因组DNA 3 109 bp2.重复序列普遍3.基因的不连续性 基因间不连续 基因内不连续(外显子-内含子交替排列)4.单顺反子,4.基因组,基因组就是来自一个遗传体系的全部遗传信息。对于原核细胞，基因组就是单个环状染色体所含的全部基因；对于真核生物，基因组就是一个生物染色体所包含的全部的DNA。,5.人类基因组计划,人类基因组计划(Human genome project,HGP)与曼哈顿原子弹计划，阿波罗登月计划共称为二十世纪最伟大的三个科研计划人类基因组计划（19932002）的最终目的是确定
4、人类24条染色体的全部核苷酸序列。人类基因组的框架已由美、英、法、日、德和中六国在2002年完成并在和发布。,二.基因表达调控的概念及原理,1.基因表达调控的概念2.基因表达的时间性和空间性3.基因表达的基本方式4.基因表达调控的基本原理5.基因表达调控的生物学意义,1.基因表达调控的概念,1.基因表达是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物学功能的整个过程，典型的基因表达是指基因组上结构基因所携带的遗传信息经过转录和翻译转变为生物活性蛋白质的过程。2.基因表达调控是指生物体内控制基因表达的机制，生物体通过各种基因表达调控元件在基因表达的各个环节调控基因的开关或表达强度使基因有序表达以
5、适应机体生存环境的机制。,2.基因表达的时间性和空间性,1.携带遗传信息的基因并不是在任何细胞和任何时间均平衡表达，这种现象称为基因表达的时间和空间的特异性。2.按照功能需要,某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发生，这就是基因表达的时间特异性。3.在多细胞生物，同一基因不仅可以表现出时间的特异性，而且在同一时间在不同的组织器官的表达并非一致和同步，这种按一定组织和器官分布的基因表达称之为基因表达的空间特异性。,1.时间特异性（temporal specificity）依功能的需要，某一个特定基因的表达严格按一定的时间顺序发生，这就是基因表达的时间特异性。2.空间特异性（spatial sp
6、ecificity）在机体的生长发育过程中，基因在个体的不同组织或器官表达，这就是基因表达的空间特异性。,3.基因表达的基本方式,1.基因表达的产物功能不同，其随环境变化而改变表达水平的必要性也就不同。据此可分为组成性表达和适应性表达。2.组成性表达是指一般不受或很少受环境变化影响的一类基因表达。这类基因的表达产物通常是生物体生命活动中必不可少的，通常被称之为”管家基因”。3.适应性表达是指容易受环境变化影响的一类基因表达，因环境变化而增强的基因表达称之为诱导性表达，反之称之为阻遏性表达。,基本表达（constitutive expression）一些基因的表达产物对机体的全过程都是必需的，这
7、些基因在所有空间（几乎全部细胞）和时间（持续）表达。这些基因称为管家基因（house keeping gene），这种表达称为基本表达或组成性表达。调节表达（regulative expression）一些基因仅在一定的环境信号刺激下表达，这些基因称为调节基因(regulative gene)，这种表达称为调节表达。受环境刺激表达增强的称为诱导（induction），受环境刺激表达降低的称为阻遏（repression）。,4.基因表达调控的基本原理,1.基因表达的调控是多级的:至少包括基因活化、基因转录起始、转录后的加工与转运、蛋白质的翻译及翻译后的加工与修饰等等。在多极调控中转录的起始是基因
8、表达调控的基本控制点，也是基因表达调控的中心环节。2.影响不同阶段基因表达调控的因素是多元的，同时影响基因转录起始的因素也是多元的。影响基因转录起始的因素可以分为两大类：一是基因自身的DNA序列，二是外在的特异性的调节蛋白。,(1)基因表达的多级调控,基因表达调控的环节是多级的：至少包括基因激活、转录起始、转录后加工、mRNA降解、蛋白质翻译、翻译后加工修饰和蛋白质降解等环节。在这众多的调控环节中，转录起始是基因表达的基本控制点，是基因表达调控的中心环节。,(2).基因转录激活的基本要素,1.自身因素-特异DNA序列2.外在因素-调节蛋白3.调节蛋白作用形式（DNA-蛋白 质，蛋白质-蛋白质相
9、互作用）4.调节的焦点-RNA聚合酶的识别与结合5.非编码RNA对基因表达的调控,特异DNA系列,1.基因表达的调节首先与基因自身的调节序列有关，如启动子，增强子和沉默子等。基因中这些可以影响自身表达活性的DNA序列遗传学上称为顺式作用元件。2.调节基因表达的其它因子如调节蛋白就是通过直接或间接与这些顺式作用元件结合而发挥调节作用。,调节蛋白,1.原核生物基因调节蛋白可分为特异因子，阻遏蛋白和激活蛋白三类，原核生物的调节蛋白都是DNA结合蛋白。2.真核生物调节蛋白又称转录调节因子或转录因子（transcription factor,TF）。多数调节蛋白是由其它的基因表达后调节另一基因的转录，故
10、又称为反式作用因子（trans-acting factors）。,调节蛋白的作用方式,1.原核生物的调节蛋白均是DNA的结合蛋白，通过直接结合DNA而发挥调节作用.2.真核生物的调节蛋白结构和功能比较复杂,可以直接结合DNA(蛋白质-DNA),也可以间接结合DNA(蛋白质-蛋白质),最终识别和结合DNA，进而调节基因的转录。,RNA聚合酶,1.基因的启动序列存在RNA聚合酶结合位点，调节蛋白对基因转录的调节最终是通过RNA聚合酶与启动序列的结合和激活体现的。2.环境因素可以通过改变蛋白质的水平和/或蛋白质的构象并进一步影响蛋白质与DNA的识别和结合调节RNA聚合酶的活性最终调控特定基因的表达。
11、,非编码RNA对基因表达的调控,1.RNA干扰(RNA interference,RNAi)2.微小RNA(micro RNA,miRNA)3.分编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)4.小干扰RNA(smal interference RNA,siRNA)有关的研究进展神速，有可能成为分子生物学研究新的增长点，值得期望和关注。,5.基因表达调控的意义,任何机体的生长和发育都是分阶段的，同时生存的环境都是变化的。基因表达调控的主要意义就是：1.维持机体的发育与分化 2.适应环境，维持生存与生长,三.原核基因的表达调控,1.原核基因的表达特点2.原核基因转录调控的特点3.乳糖操纵
12、子的结构4.乳糖操纵子的转录调控,1.原核基因的表达特点,1.原核生物多为单细胞生物，缺乏细胞核。基因的转录和翻译可以同时进行。2.原核生物的基因是连续的，没有内含子。一个mRNA可以翻译成为几个蛋白质，即 多顺反子。3.原核生物的基因表达也可分为组成性表达 与调节性表达。4.操纵子是原核生物基因表达和调控的基本 单位。,2.原核基因转录调控的特点,1.原核生物只有一种RNA聚合酶，不同的因子 决定特异基因的转录激活。2.操纵子模型的普遍性：原核生物的绝大多数基因按其功能相关性成簇地串联排列在染色体上并与其调控元件共同组成的一个转录单位称之为操纵子。3.阻遏蛋白和阻遏机制的普遍性：在原核生物的
13、操纵子中多存在阻遏元件，特异的阻遏蛋白与阻遏元件的结合或解离就会发生特异结构基因的阻遏或去阻遏。,3.乳糖操纵子的结构,1.乳糖操纵子由结构基因和调控序列组成。2.结构基因位于操纵子的下游，由Z、Y和A三个 结构基因组成，它们分别编码半乳糖苷酶、通 透酶和乙酰化酶。Z、Y和A基因共同转录生成 一条多顺反子mRNA。3.调控序列位于乳糖操纵子的上游，由阻遏基因(I)、启动子（P）和操纵序列（O）组成。阻遏 基因编码阻遏蛋白；操纵序列存有阻遏蛋白结 合位点；启动子序列有RNA聚合酶结合位点，在其上游还有一个代谢物基因激活蛋白(CAP)结合位点。,4.乳糖操纵子的转录调控,1.细菌的生存需要碳原子，
14、碳源的供 应有多种来源，如葡萄糖，乳糖等。2.不同碳源化合物的代谢需要不同酶的 参与和催化，酶是基因表达的产物。3.各种碳源化合物的利用经济性是有差 别的，多种酶同时表达是不经济的。4.操纵子是原核生物基因表达调控的基 本方式。,What is an Operon?,1.Group of open reading frames(ORFs)all under the control of one region(one ON/OFF switch)2.Transcribed as one mRNA3.The ORFs are involved in the same biochemical pat
15、hway4.No energy wasted in making proteins the cell doesnt need5.Only in prokaryotes,The lac Operon,1.Found in E.coli2.One of the most widely studied and well known operons3.Involved in the catabolism of lactose into glucose and galactose4.It is an inducible system It is OFF until something(lactose)t
16、urns it ONA repressible system is ON until something turns it OFF(i.e.tryptophan operon),Structure of lac Operon,1.Regulatory RegionsPromoter:site where the RNA polymerase bindsOperator:binding site for the repressor proteinCRP binding site:site where the cAMP receptor protein(CRP)binds2.Coding regi
17、onsZ:codes for b-galactosidase,which hydrolyzes lactose into glucose and galactoseY:codes for permease,which allows lactose to enter the cellA:codes for transacetylase,which is not well understood,Structure of lac Operon,Regulation of the lac Operon,Negative controlBinding of a regulatory protein tu
18、rns the operon OFFIn the lac operon,repressor binding to the operator turns the lac operon OFF,lac operon is under both negative(the repressor)and positive(CAP)control,Regulation of the lac Operon,Positive controlBinding of a regulatory protein turns the operon ONIn the lac operon,CRP binding to the
19、 promoter accelerates the operonHowever,CRP cannot bind without cAMP thus glucose is used first(high glucose means low cAMP;low glucose means high cAMP)Volume control,b-galactosidase induction and assay,Four carbon sources are then added to the mediaLactose:induces the lac operonIPTG:induces the lac
20、 operon but does not need permease to enter the cellLactose+glucose:glucose is the preferred carbon source Glycerol:does not induce the lac operonCells are lysed with chloroformb-galactosidase production is assayed using ONPG,By plating the colonies in the presence of isopropyl beta-D-thiogalactosid
21、e(IPTG)and the color-changing substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-(arentyougladyoutookorganic)-pyranoside(X-gal),one can obtain the following color test:,-Gal assay:blue white screening,The mechanism of blue white screening,The reason this works is that the IPTG de-represses the lac
22、operon,by binding to the lac repressor(the lac I gene product),preventing it from binding to the operator.The lacZ-alpha fragment is therefore transcribed and translated,and forms a functional beta-galactosidase enzyme.The substrate X-gal,when cleaved,leaves a water-insoluble blue product that marks
23、 the colonies.A blue color indicates an intact lacZ-alpha gene,and that implies that no interruption of the gene took place during cloning.,Applications:LacZ gene is often used as a reporter gene for expression in recombinant tissues.,Mammalian promoter(c-fos),pUC19,Gene to be induced,LacZ,Applicati
24、ons:LacZ reporter vector used for successful gene delivery in gene therapy(lacZ selection)LacZ promoter used to induce expression of fused gene of interest,四.真核基因的表达调控,1.真核基因的表达特点2.真核基因转录调控的特点3.转录前水平的调控4.转录水平的调控5.转录后水平的调控,1.真核基因的表达特点,1.真核生物多为多细胞生物，具有细胞核。基因的转录和翻译分别进行。2.真核生物的基因是不连续的，具有内含子。一个mRNA一般只表达为
25、一个蛋白质，即 单顺反子。3.真核生物合成的蛋白质需要经历多种加工 折叠才能成为具有活性的物质。4.真核生物基因表达的调控更为复杂，至少 包括转录、翻译及蛋白质的加工修饰和降 解等等。,2.真核基因转录调控的特点,1.真核生物的基因表达调控远比原核生物复杂，包括转录前、转录、转录后、翻译和翻译后等环节，转录仍然是关键环节。2.真核生物的染色体更为复杂，可以有活化状态和异染色质化状态两种。3.真核生物具有多种RNA聚合酶，其中的RNA聚合酶负责转录生成mRNA，RNA聚合酶 并不与启动子直接结合。4.真核生物不存在操纵子结构。5.真核生物普遍存在反式作用因子，既转录因子。反式作用因子不仅众多，而
26、且彼此相互作用复杂。,3.转录前水平的调控,1.DNA顺序的改变：基因重排与 基因扩增2.染色质的改变3.表观遗传改变,染色体的结构变化,染色体的结构变化是基因活化的重要结构基础和表现形式。染色体的结构变化有多种形式，如DNA拓扑结构变化，对核酸酶的敏感性变化，DNA碱基修饰变化等.这些变化多是转录调节因子与DNA特定结构部位相互作用的结果。,4.转录水平的调控,真核生物基因的转录主要涉及三种因素的相互作用：RNA聚合酶，顺式作用元件和反式作用因子。1.RNA聚合酶 2.顺式作用元件 3.反式作用因子 4.三种因子的相互作用,1.RNA聚合酶,1.原核细胞RNA聚合酶仅一种，而真核 细胞RNA
27、聚合酶有三种：，和，此外还有线粒体RNA聚合酶。2.真核细胞RNA聚合酶由更多的亚基组 成,结构更为复杂。3.真核细胞RNA聚合酶并不能直接识别 和结合起始序列，而是需要转录因子 的参与和连接。,2.顺式作用元件,1.顺式作用元件是DNA自身的序列，是转录激活因子直接或间接识别与结合的部位所在。2.真核基因启动子是RNA聚合酶结合位点及其周围的一组转录调控组件。启动子至少包括转录起始点和其他机能组件，如TATA盒，GC盒或CAAT盒.3.增强子是远离转录起始点，决定基因转录的时间、空间特异性，增强启动子转录活性的DNA序列。4.沉默子是与调节蛋白结合并能减弱启动子转录活性的DNA序列。,3.反式作用因子,反式作用因子可分为RNA聚合酶结 合启动子所必需的基本转录因子和个别基因转录所需要的特异转录因子。2.转录因子组成繁多，结构各异，但基本均具有DNA结合域和转录激活域。3.常见的DNA结合域结构有结合GC盒的锌指结构，结合CAAT盒的碱性亮氨酸拉链等。,4.三种因子的相互作用,5.转录后水平的调控,1.信使RNA(mRNA)的加工,.5端帽子的形成.3多聚腺苷酸加尾.内含子的切除和外显子的剪接.化学修饰.RNA的编辑,5末端帽子的形成,先后经过磷酸酶水解，鸟苷酸的转移和甲基化，最终形成5-m7GpppNmp-的帽子,
