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1、第六章 生物工艺过程控制,研究菌体的培养规律、外界控制因素 对过程影响及如何优化条件，达到最 佳效果是发酵工程的重要任务,发酵过程中的代谢变化与控制参数 温度对发酵的影响及其控制 pH值对发酵的影响及其控制 溶解氧对发酵的影响及其控制 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制,CO2和呼吸商补料的控制泡沫对发酵的影响及其控制,对于产物形成而言，代谢变化就是反映发酵过程中的菌体生长、发酵参数的变化和产物形成速率三者之间的关系。微生物的代谢产物，按其与菌体生长、繁殖的关系来说，又分为初级代谢产物（primatymetabolite)和次级代谢产物（s-econdary metabolite),初级代谢的
2、变化 次级代谢的变化 发酵过程的主要控制参数,变化的根本原因在于菌体的代谢活动引起环境的变化，而环境的变化又反过来影响菌体的代谢。在初级代谢中，菌体生长仍显示适应期、对数生长期、静止期和衰亡期的特征。由于菌体的生理状态与培养条件不同，各个时期时间长短也不尽相同，且与接种微生物的生理状态有关,工业发酵中往往要接入处于对数生长期的菌体，以尽量缩短适应期。基质浓度的变化一般随发酵时间的延长而不断下降。溶解氧浓度亦随发酵过程的变化而发生变化 初级代谢产物由于没有明显的产物形成期，所以它是随菌体生长在不断地形成。,次级代谢产物包括大多数的抗生素、生物碱和微生物毒素等物质。属非偶联型，次级代谢产物的变化一
3、般分为：,菌体生长阶段,产物合成阶段,菌体自溶阶段,在这个过程中，碳源和氮源等进行分解代谢，菌体进行合成代谢。碳源、氮源和磷酸盐等营养物质不断被消耗，浓度明显降低。随着新菌体不断合成，菌体浓度明显增加，摄氧速率也不断增大，溶解氧浓度不断下降。pH值随基质代谢的变化，也发生一定的改变。,此期间，产物的产量逐渐增加，直至达到高峰，生产速率也达到最大，直至产物合成能力衰退。此阶段，产生菌的呼吸强度一般无显著变化。这个阶段的代谢变化是以碳源和氮源的分解代谢和产物的合成代谢为主。,此时，碳源、氮源和磷酸盐等的浓度必须控制在一定范围内，并严格控制发酵条件。,贮藏期：细胞积累脂肪和糖的过 程。使干重增加，开
4、始 形成产物,持续期：细胞干重不变，但继续 耗糖和分泌产物。,此阶段，菌体衰老，细胞开始 自溶，氮含量增加，pH之上升 产物合成能力衰退，生产速率 下降。,pH值：发酵液的pH只是发酵过程中各种生化反应的综合结果，它的高低与菌体生长和产物合成有着重要关系。温度：它的高低与发酵液中的酶反应速度、氧在培养液中的溶解度和传递速率、菌体生长速率和产物合成速率密切相关。,溶解氧浓度：利用溶解氧浓度的 变化，可了解产生菌产生菌对氧 利用的规律，反映发酵的异常情 况，也可作为发酵中间控制的参 数及设备供氧能力的指标。基质含量：它是发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。它的 变化对产生菌的生长和产物的合 成
5、有着重要的影响，也是提高代 谢产物产量的重要控制手段。,空气流量：每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积。一般控制在0.51.0(Lmin)罐内维持正压，以保证纯种培养，间接影响菌体代谢。一般维持在0.20.5105Pa,在发酵的不同阶段控制不同的转数，以调节培养基中的溶氧。它的大小与氧在发酵液中的传递速率和发酵液的均匀性有关。搅拌功率、粘度、浊度、料液流量、产物浓度、氧化还原电位、废气中的氧含量、废气中CO2含量、菌体浓度等。,温度对发酵的影响影响发酵温度变化的因素温度的控制,温度的变化会影响酶反应的速率，改变菌体代谢产的合成方向，影响微生物的代谢调控机制，影响发酵液的理化性质，进而影响发酵
6、的动力学特性和产物的合成。,Q发酵=Q生物+Q搅拌 Q蒸发 Q显 Q辐射,Q生物：产生菌在生长繁殖过程中产生的热能。生物热的大小，随菌种和培养基的不同而变化。一般而言，同一菌种，在同一条件下，培养基成分越丰富，营养被利用的速度越快，产生的生物热就越大。,生物热的大小随培养时间的不同而不同。生物热的大小与菌体的呼吸强度有对应关系，呼吸强度越大，所产生的生物热也越大,Q搅拌：搅拌器转动引起的液体之间及液体与设备之间的摩擦所产生的热量。,Q搅拌=,()3600,P,V,Q蒸发:空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后,排出引起水分蒸发所需要的热能,最适温度的选择：最适发酵温度随着微生物菌种、培养基成分、培养
7、条件和菌体生长阶段的不同而不同。在菌体的生长阶段，应选择最适生长温度；在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。,温度的控制：工业生产上通常将冷却水（或冷媒）通入发酵罐夹层或蛇形管中，通过热交换来降温，以维持最适温度。,pH值对发酵的影响发酵过程中pH值的变化发酵pH制的确定及控制,影响酶的活性 H+或OH-在细胞内改变了胞内原有的中性状态，影响到酶蛋白的解离度和电荷情况，从而改变酶的结构和功能。影响微生物原生质膜所带电荷的状态。,影响培养基中某些组分的解离，进而影响到微生物对这些成分的吸收不同的pH值，往往引起菌体代谢过程的不同,使代谢产物的质量和比例发生改变。pH值对产物的稳定性也有影响,发酵过
8、程中，pH值的变化，取决于所使用的菌种、培养基成分和培养条件。发酵过程中，随着微生物对培养基中营养物质的利用及某些物质的积累，发酵液的pH值会发生一定的变化。,微生物的自溶，引起发酵液中氨基酸等的增加，会使pH值增加发酵所用的碳源种类不同，pH值变化也不一样。凡是发酵过程中，碱性物质的消耗和酸性物质的生成或释放都会引起发酵液中pH值下降。,引起pH值下降的主要原因,培养基中C/N比例不当，碳源过多，尤其是葡萄糖或中间补糖过多，加之溶解氧不足，致使大量有机酸积累，引起pH值下降消泡油加得过多。生理酸性物质的存在，氨被利用，使pH值下降。,引起发酵液pH值上升的主要原因,C/N比例不当，氮源过多，
9、氨基氮释放，使pH值上升生理碱性物质的存在。中间补料中氨水或尿素等碱性物质的加入过多，使pH值上升,发酵pH值的确定发酵pH值的控制,微生物发酵的pH值随菌种和产品的不同而不同同一菌种，其生长得最适pH值可能与产物合成的最适pH值是不一样的发酵过程中，应根据不同阶段分别控制pH值最适pH值可根据实验确定在确定发酵适宜的pH值时，应考虑培养温度对它的影响,菌体的比生长速率与产物的比生产速率的最适pH都在一个相似的较宽的适宜范围内OP(或）的最适pH值范围很窄，而（或QP）的范围较宽 或QP对pH值都很敏感，他们的最适pH值又是相同的 和QP有各自的最适pH值,QP,QP,QP,QP,pH值,pH
10、值调节、控制的主要方法,选择合适的培养基，调节培养基原始的pH值。在分批发酵中常用CaCO3作为缓冲剂来控制pH值的变化可在发酵过程中加入弱酸或弱碱进行pH制的调节，如果此法不能改善发酵情况，应采用补料的方法,补料：补加生理酸性物质如（NH4)2SO2或生理碱性物质，他们可以调节pH值、补充营养物质、增加培养液浓度和减少阻遏作用。当发酵液的pH值较高及氮含氨量又较低的时候，可加入生理酸性铵盐调节；当发酵液的pH值和氨氮含量都很低时，可补加氨水（浓度20%左右）应采用少量多次流加的方法进行,溶解氧对发酵的影响供氧与微生物代谢的关系发酵过程溶解氧的变化溶解氧浓度的控制,培养基的成分和浓度显著影响耗
11、氧：培养液营养丰富，菌体生长快耗氧量大；发酵醪浓度高，耗氧量大；发酵过程补料或补糖，微生物对氧的摄取量随之增大菌龄影响耗氧：菌体呼吸旺盛时，耗氧量大；发酵后期，耗氧量减少,影响耗氧的主要因素,发酵条件影响耗氧：在最适宜的条件下发酵，耗氧量大发酵过程中，有毒代谢产物如CO2、挥发性的有机酸和过量的氨的排出，有利于提高菌体的摄氧量,临界溶氧浓度：满足微生物呼吸的最低氧浓度,在临界氧浓度下，微生物的呼吸速 率随溶解氧浓度的降低而显著下降 当不存在其他限制性因素时，溶解 氧浓度高于临界值时，细胞的比耗 氧速率保持恒定,如果溶解氧浓度低于临界值，细胞 的比耗氧速率，就会大大降低，细 胞处于半厌气状态最适
12、氧浓度与菌体合成和产物的合成代谢的特性有关。如：,谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和 脯氨酸等谷氨酸系的氨基酸，它们在菌体呼吸充足的条件下 产量最大 如果供氧不足，氨基酸合成就 会受到强烈抑制，大量积累乳 酸和琥珀酸,异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸等氨基酸，供氧充足，可得到最高产量，但供氧受限时，对产量的影响并不明显亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，仅在供氧受限，细胞呼吸受抑制时，才能获得最大量的氨基酸,呼吸强度：单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧的量（QO2 单位mmol/（g干菌体h）耗氧速率：单位体积培养液，在单位时间内得吸氧量（r 单位：mmolO2/hL）,r取决于微生物的呼吸强度和单位体积
13、菌体浓度,r=QO2c(X),发酵过程中，供氧的多少应根据不同 的菌种、发酵条件和发酵阶段等具体 情况决定,发酵前期，需氧量不断增加，此时需氧量超过供氧量，使溶解氧明显下降，摄氧率同时出现一个高峰发酵中后期，分批发酵溶解氧变化较小，如不补加基质，发酵液的摄氧率与菌体的呼吸强度变化不大，供氧能力保持不变，溶解氧浓度变化也不大,当外界进行补料时，则溶解氧浓度就会发生变化，如补糖后，发酵液的摄氧率就会增加，引起溶解氧浓度下降，经过一段时间后又会逐步回升生产后期，呼吸强度减弱，溶解氧浓度也会逐步上升,引起溶解氧异常下降的主要原因污染好气性杂菌菌体代谢发生异常，需氧量增加，使溶解氧下降某些设备或工艺控制
14、发生故障或变化，可能引起溶解氧下降,引起溶解氧异常升高的原因在供氧条件没有发生变化的情况下，主要是耗氧发生改变所致，如菌体代谢出现异常、耗氧能力下降，特别是污染了烈性噬菌体，影响尤为突出,供氧方面,OTR=kL(c*-cL)=(QO2)m,cLc(X),Ko+cL,设法提高氧传递的推动力，如增加罐 压、采用富氧通气操作 提高液相体积氧传递系数kL,（如调 节搅拌转速或通气速率，或改变发酵 液的流动状态等）,需氧方面,发酵液的需氧量受菌体浓度、基质的种类和浓度以及培养条件等因素的影响发酵液的摄氧速率随菌体浓度的增加而按比例增加氧的传递速率是随菌体浓度的对数关系减少,控制补料速度，使微生物菌体浓度
15、维持在最适范围内调节温度液化培养基中间补水添加表面活性剂,菌体浓度对发酵的影响及控制基质对发酵的影响及其控制,菌体浓度(cell concentration)是指单位体积培养液中菌体的含量。菌体浓度的大小，在一定条件下不仅反映了菌体细胞的多少，而且反映了菌体细胞生理特性不完全相同的分化阶段,菌体浓度的大小与菌体生长速率密切相关，比生长速率大的菌体，菌浓增长迅速，反之就缓慢菌浓的增长与营养物质和环境条件密切相关,生长速率取决于基质浓度当c(S)10KS时，m,在此限度内，菌体的比生长速率随基质浓度的增加而增加。超过此限度，基质浓度的增加会引起生长速率下降,c(S),=,m,Ks,+,c(S),菌
16、浓的高低，对发酵产物的得率有着至关重要的影响,在适宜的比生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比例关系，即：P=(QP)mc(X)但菌浓过高，可能会改变菌体的代谢途径，对溶解氧的影响尤为突出,随着菌体浓度的增加，培养液的摄氧率按比例增加，表观黏度也随之增加，流体的性质亦发生改变，使氧的传递速率成对数减少当OUROTR，溶解氧减少，并成为限制性因素，随之给发酵带来各种影响,r=QO2c(X),如代谢途径的改变，酵母生长停滞；抗生素发酵中，使产量下降等,确定基础培养基的适当比例，以避免菌体浓度过浓（或过稀）通过中间补料控制菌体的生长，当菌体生长缓慢，菌体浓度过低时，可补加部分磷酸盐，以促进其生长
17、可利用菌体代谢产生的CO2的量来控制生产过程的补糖,碳源对发酵的影响及其控制氮源的种类和浓度对发酵的影响及其控制磷酸盐浓度对发酵的影响及其控制,迅速利用碳源：能较快地参与代谢，合成菌体和产生能量，并产生分解产物，有利于菌体生长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用缓慢利用碳源：,被菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于抗生素的分泌期，为许多微生物药物发酵所利用碳源浓度对菌体代谢、产物的形成及氧的传递都会产生影响。浓度过大，导致菌体异常繁殖,如产生阻遏作用的碳源用量过大，产物的合成会受到明显的抑制若仅仅提供维持量的碳源，均提的生长和产物合成都会停止,发酵过程中通过中间补料的
18、方法来控制这主要是根据不同的代谢类型来确定补糖时间、补糖量和补糖方式,不同种类和不同浓度的氮源都会影响产物的合成方向和产量快速利用氮源易被菌体利用，可促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，尤其是对某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量,缓慢利用氮源对延长次级代谢产物的分泌期，提高产物的产量是有益的，但不可一次投入,发酵培养基选用含有快速利用和缓慢利用的混合氮源发酵过程中补加氮源补加有机氮：根据产生菌的代谢情况，可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮（如酵母粉、玉米浆、尿素等）,补加无机氮源：补加氨水或硫酸铵,磷是菌体生长繁殖和合成代谢产物所必需的成分微生物生长良好所必需的磷酸盐浓度
19、0.32300mmol/L，但对于次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol/L,磷酸盐浓度的控制，一般是在基础培养基中采用适当的浓度在发酵过程中，有时会出现代谢缓慢的情况，可补加磷酸盐改善,CO2对菌体生长和产物形成的影响排气中CO2浓度与菌体量、pH值、排气氧之间的关系呼吸商与发酵的关系CO2浓度的控制,CO2对往往菌体生长有直接的影响。当排出的CO2浓度高于4%时，碳水化合物的代谢及微生物的呼吸速率下降；基质的异化和ATP的生成也将受到阻碍，从而影响产物的合成,菌体生长的检测 补糖与排气CO2、pH值变化的关系,CRR(carbon dioxide release rad
20、io 二氧化碳释放率),CRR=,QCO2c(X)=,F进,V,C惰进 CCO2,1-(CO2出+CCO2出),-CCO2进,f,QO2,比二氧化碳释放率，mol CO2/(g菌h),c(X),菌体干重，g/L,F进,进气流量,C惰进、CCO2进,分别为排气中惰性气体、二氧化碳的体积百分数,CCO2出、CO2出,分别为排气中二氧化碳、氧的体积分数,V,发酵液的体积，L,f=,273,273+t进,P进,t进,进气温度,P进,进气绝对压强，Pa,通过测定排气中CO2浓度的变化，采用控 制流加基质的方法，来实现对菌体的生长 速率和菌体量的控制,发酵液中补加葡萄糖，排气中CO2浓度增加，pH值下降其
21、原因有二：其一是因为葡萄糖被菌体利用产生CO2，其中溶解于培养液中的CO2使培养液的pH值下降其二是因为葡萄糖被利用的过程中，产生有机酸，使pH值下降,耗氧速率(oxygen uptake rate，简称OUR 单位 molO2/(hL),OUR=,QO2c(X)=,F进,V,CO2进-,C惰进CO2出,1-(CCO2出+CO2出),f,QO2,呼吸强度，molO2/(gh),RQ=,CRR,OUR,呼吸熵可以反映菌体的代谢情况，是碳-能源代谢情况的指示值。在碳-能源限制及供养充分的情况下，碳-能源趋于完全氧化 菌体在不同的基质中，RQ也不同 在抗生素发酵中，菌体在不同的阶段其RQ值也不一样,
22、CO2的溶解度随压力的增加而增加 CO2浓度的控制应随它对发酵的影响而定。如果CO2对产物合成有抑制作用，则应设法降低其浓度；若有促进作用，则应提高其浓度,改变搅拌和通气速率的大小调节罐压，将影响到CO2的浓度，同时对菌体代谢和其他参数也会产生影响,在发酵罐中不断通入空气，既可保持溶解氧在临界点以上，又可随废气排出所产生的CO2，使之低于能产生抑制作用的浓度降低通风量，有利于增加CO2在发酵液中的浓度；反之则会减小CO2浓度,补料分批培养（fed-batch culture，简称FBC）的作用补料的方式及控制,可控制抑制性底物的浓度可以解除或减弱分解代谢物的阻遏可以使发酵过程最佳化,流加操作控
23、制系统,反馈控制,无反馈控制,依据控制指标的不同,直接方法,间接方法,间接法是以溶解氧、pH值、呼吸熵、排气中CO2分压及代谢产物浓度等作为控制参数选择与过程直接相关的可检参数作为控制指标,对于通气发酵，利用排气中CO2含量作为FBC作为反馈控制参数。它是依靠精确测量CO2的逸出速度和葡萄糖的流动速度，达到控制菌体的比生长速率和菌浓pH值也可用作糖的流加控制参数,泡沫的形成及其对发酵的影响泡沫的消除,蛋白质类原料：蛋白胨、玉米浆等,糖,脂肪,发酵时起泡的方式,发酵过程中，泡沫保持恒定,发酵早期，起泡后稳定的下 降，以后保持恒定,发酵前期，泡沫稍微降低后 又开始回升,发酵开始起泡能力低，以 后上
24、升,综合方式,调整培养基中的成分或改变某些物理化学参数或者改变发酵工艺 采用机械消泡或化学消泡的方法 筛选不产生流态泡沫的菌种,利用机械强烈振动或压力变化而使泡沫破裂,罐内消泡：靠消泡浆转动打碎泡沫,罐外消泡：靠喷嘴的加速作用或离心力来消除泡沫,节省原料，减少染菌机会，但消泡效 果不理想,化学消极的作用或者是降低泡沫液膜的机械强度，或者是降低液膜的表面黏度，或者二者兼而有之,在气-液界面上具有足够大的铺展系 数，即消泡剂要有一定的亲水性 在水中的溶解度必须较小，以保持 持久的消泡抑泡性能,应不影响氧在培养液中的溶解和传递对人、蓄及微生物细胞无毒性来源方便、广泛，价格便宜能耐高温,常用消泡剂,天
25、然油脂类：豆油、玉米油、棉籽油等,脂肪酸和脂类：聚丙烯甘油,聚醚类：它们是氧化丙烯或氧化丙烯和环氧乙烷与甘油聚合而成的聚合物,硅酮类：较适用微碱性的细菌发酵,使发酵罐的装填系数减少造成大量逃液，导致产物的损失泡沫“顶罐”，从排气管路或轴封逃出增加了染菌的机会影响通风搅拌，妨碍了微生物的呼吸，造成发酵异常,影响了微生物群体的效果，增加了微生物群体的非均一性,pH值：pH值的高低与菌体的生长和产物合成有着重要关系 温度：它的高低与发酵中的酶反应速率、氧在发酵液中的溶解度和传递速率、菌体生长速率和产物合成速率等密切相关 溶解氧浓度：利用溶解氧浓度的变化，可了解产生菌对氧利用的规律，反映发酵的异常情况
26、，也可作为发酵中间控制的参数及设备供养能力的指标,基质含量：基质浓度的变化对产生菌的生长和产物的合成有着重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段 空气流量：它的大小与氧的传递和其他控制参数有关，一般控制在0.51.0（L/Lmin）,压力：发酵过程中罐内维持一定的正压可防止杂菌污染，罐压的高低还与氧和CO2在培养液中的溶解度有关 搅拌转速：它的大小在一定程度上与发酵液中氧的传递速率和发酵液的均匀性有关 搅拌功率：与氧的容量传递系数有关,黏度：可作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况 浊度：能及时反映单细胞生长状况的参数。料液流量：产物的浓度：衡量发酵产物产量
27、高低或合成代谢正常与否的重要参数,氧化还原电位：是影响微生物生长及其生化活性的因素之一。废气中的氧含量：由废气中氧和CO2含量可算出产生菌的摄氧率、呼吸商和发酵罐的供氧能力废气中的CO2的含量,菌体形态：一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一菌体浓度：是控制微生物发酵的重要指标,生物工业理想消泡剂应满足的条件 工业生产中常用的消泡剂,在气-液界面上具有足够大的铺展系数 在低浓度时应具有消泡活性 具有持久的消泡或抑泡性能 应对人类、微生物和动物无毒性 应对产物的提取没有任何影响,不会在使用、运输中引起任何危害 来源方便，成本低 对氧的传递应不产生影响 能耐高温灭菌,天然油脂类,脂肪酸和酯类,聚醚类,硅酮类,谢谢大家,谢谢大家 再见！,
