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1、摘 要摘 要从土壤中筛选出一株产-半乳糖苷酶的枯草芽孢杆菌，并对菌株和其产生的-半乳糖苷酶进行了测定。单菌落的最佳生长时间是10h，最佳接种量是2.0%，最佳培养时间24h；该菌株产生的-半乳糖苷酶的最适pH是6.5，最适生长温度为37，酶的稳定性较高，4h后相对酶活仍能维持85%以上；Mg2+对酶活性的促进作用最强，当浓度为10 mmol/L时，酶活力可达112.24，Cu2+对酶活性抑制作用最强，少量Cu2+（1mmol/L）就可使酶失活。本实验还进行了-半乳糖苷酶的固定化实验。以海藻酸钠为栽体、戊二醛为交联剂，对乳糖酶进行固定化。研究了海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、戊二醛浓度、固定化时间对酶
2、固定化的影响，并对固定化酶酶促反应的最适pH、温度等进行了测定。结果表明，4的海藻酸钠，在温度37、pH67、氯化钙浓度1、戊二醛浓度0.1%下对乳糖酶的固定化率最高。酶促反应特性测定结果表明，固定化后乳糖酶的稳定性增强，最适温度范围较非固定化乳糖酶大，最适pH范围与非固定化乳糖酶大致相同。但固定化酶珠体机械强度较差，尚待改进。关键词：-半乳糖苷酶 酶活性 酶的固定化IAbsractAbsractA strain isolated from soil in producing -galactosidase of Bacillus subtilis, and strains and -galac
3、tosidase were measured which produces. A single colony of the best growth time is 10h, the best inoculum was 2.0%, the best culture time 24h; optimum pH -galactosidase enzyme produced by this strain is 6.5, the optimum temperature is 37, enzyme high stability, 4h after the relative activity can be m
4、aintained above 85%; Mg2+ on the activity of promoting the strongest, when the concentration of 10 mmol/L, the enzyme activity of up to 112.24%, Cu2+ inhibition of enzyme activity most, a small amount of Cu2+ (1mmol/L) can inactivate the enzyme.The experiments were also -galactosidase immobilization
5、 experiments. The lactase was immobilized on sodium alginate carrier by cross-link with glutaraldehyde. The effects of flutaraldehyde concentration, amount of the enzyme and temperature immobilization were analyzed. The reaction conditions (optimun pH and temperature) of the immobilized lactase were
6、 studied. The results show that the high recovery rate of immobilized enzyme could be obtained under the conditions of 0.1% glutaraldegyde, 4% sodium alginate and 37 temperature. Keyword: -galactosidase, enzymes activity, Immobilization of enzymeI目 录目 录摘 要IAbsractII目 录III第1章 绪论11.1 研究背景11.2 课题研究目的和意
7、义21.3 国内外研究现状和发展趋势21.4 -半乳糖苷酶的来源及其特性41.4.1 细菌产生的-半乳糖苷酶41.4.2 酵母菌产生的-半乳糖苷酶41.4.3 霉菌产生的-半乳糖苷酶41.5 -半乳糖苷酶在食品工业中的应用51.5.1 水解牛乳和其它乳制品中的乳糖51.5.2 生产低聚半乳糖(Galactooligosaccharide)61.5.3 分析食品中乳糖含量71.5.4 -半乳糖苷酶在制药工业中的应用71.5.5 -半乳糖苷酶在酶联免疫反应(EIA)中的应用7第2章 材料和方法82.1 材料82.1.1 材料与试剂82.1.2 仪器与设备82.1.3 培养基82.2 产-半乳糖苷酶
8、菌的筛选92.2.1 菌株筛选方法92.2.2 分离纯化92.2.3 菌种生理生化鉴定92.2.4 -半乳糖苷酶粗酶液制备92.2.5 邻硝基苯酚（ONP）标准曲线92.2.6 -半乳糖苷酶酶活力测定102.3 -半乳糖苷酶酶学性质102.3.1 菌种生长曲线测定102.3.2 培养时间对菌株产酶能力的影响102.3.3 接种量对菌株BGJ222产酶能力的影响102.3.4 pH值对-半乳糖苷酶活力和稳定性的影响102.3.5 温度对-半乳糖苷酶活力和稳定性的影响。112.3.6 不同金属离子及离子浓度对-半乳糖苷酶的影响。11第3章-半乳糖苷酶酶学性质123.1 高产-半乳糖苷酶细菌的筛选1
9、23.2 邻硝基苯酚（ONP）标准曲线123.3 菌株生长曲线测定133.4 培养时间对菌株产酶能力的影响143.5 接种量对菌株产酶能力的影响14III3.6 pH对酶活性和稳定性的影响153.7 温度对酶活性和稳定性的影响163.8不同金属离子及离子浓度对-半乳糖苷酶的影响17第4章 酶的固定化研究194.1固定化酶简介194.2 酶的固定方法204.2.1 包埋法204.2.2 吸附法204.2.3 吸附法204.2.4交联法204.3 固定化酶反应器的类型214.3.1连续操作搅拌式反应器(Continuous Flow Stirred Tand Reactor，CSTR)214.3.
10、2固定床反应器(Packed Bed Reactor，PBR)224.3.3流化床反应器(Fluidzed Bed Reactor，FBR)234.3.4中空纤维反应器(Hollow Fiber Reactor)234.4 固定化乳糖酶国内外研究进展244.4.1 国外研究进展244.4.2 国内研究进展254.5 -半乳糖苷酶的固定264.5.1 包埋材料选择264.5.2 -半乳糖苷酶固定方法264.5.3 固定酶活力测定264.6 固定化的最适条件274.6.1 海藻酸钠浓度的确定274.6.2 CaCl2浓度的确定274.6.3 固定化时间的确定284.6.4戊二醛交联试验284.7
11、固定化酶的酶学性质294.7.1 固定化酶的最适pH294.7.2固定化酶的最适温度304.8 固定化酶的催化反应机理探讨304.8.1 固定化酶对反应体系的影响314.8.2 影响固定化酶的动力学因素314.9 固定化酶保护剂的筛选32参 考 文 献34致 谢35III第1章 绪 论第1章 绪 论1.1 研究背景-半乳糖苷酶（-galactosidase），全名为-D-半乳糖苷水解酶（-D-galactoside- galcagalcato-hydrolase，EC.3.2.1.23），常简称为乳糖酶。一般说来，该酶有两种催化性质：一是催化水解反应，将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖；二是催化转移反
12、应，在乳糖分子的半乳糖一侧连接14个半乳糖，生成低聚半乳糖(galactooligosaccharide,GOS)；在乳糖水解产物半乳糖一侧连接果糖，生成乳果糖（lactulose）。图1 乳糖水解机理-半乳糖苷酶的分子540kD，为四聚体结构。其结构基因为LacZ(半乳糖苷酶)，与LacY（半乳糖苷透性酶）和LacA（半乳糖苷转乙酰酶）共同组成乳糖操纵子，并在特异的乳糖操纵系统中的阻遏物、操纵基因、启动子等的协同下，支配调节-半乳糖苷酶的合成。当培养基中无诱导物质时，每一细胞中虽然没有几个分子的-半乳糖苷酶，但一旦被诱导，则每一世代都能合成多达几千个分子的酶。-半乳糖苷酶可用于治疗乳糖不耐症
13、。几乎所有的哺乳动物在断奶后将失去分泌乳糖酶的能力，仅有极少数能在其肠道内保持较高的乳糖酶活性。乳糖酶缺乏症人群的乳糖摄入量超过其胃肠消化能力时，就会导致乳糖代谢不完全。未被消化的乳糖在渗透压的作用下进入肠内被其他细菌分解代谢，会生成乳酸以及其他有机酸，导致消化不良和胃肠不适。可见，未被消化的乳糖及有机酸的渗透作用是酸性腹泻的诱发剂。此外，主要碳水化合物为乳糖的牛奶是一种全价营养食品，可以为人体提供蛋白质、能量、钙、磷和钾等多种营养，促进人体健康。但是由于乳糖不耐症的存在，很多人难以食用牛奶或其他乳制品，这极大地抑制了乳品行业的发展。乳糖消化的程度取决于以下几种因素：乳糖摄入量、在肠胃内停留时
14、间（由饮食时间决定）、-半乳糖苷酶摄入量以及乳制品摄入量。科研人员通过对乳糖不耐症与乳糖摄入量关系的大量研究，发现乳糖的摄入量与乳糖不耐症的严重程度具有直接的关系：摄入较少剂量的乳糖（少于12g或一杯牛奶）不会导致乳糖不耐症，而摄入较高剂量的乳糖（20g50g）时则会导致较为严重的乳糖不耐症。因此解决乳糖不耐症最好的办法是将乳糖从食物中去除，以无乳糖配方的形式供给人体。常见的去除乳糖的方法有大豆配方和水解配方，然而大豆配方对于体重小于1.8kg的早产儿其营养成分远远不够，因此开发可以分解乳糖的酶或微生物以水解配方解决乳糖不耐症的方法成为研究的主要方向。1.2 课题研究目的和意义-半乳糖苷酶可以
15、有效降低乳制品中乳糖含量。在酸奶发酵中，向牛奶中接种保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）进行发酵，可分解掉牛乳中2550%的乳糖，使牛奶中乳糖含量降至约4%。乳酸菌定植于肠道内，它们仍能代谢被摄入人体内的乳糖。因此，乳酸菌可以广泛用于各种乳品加工生产低乳糖制品。采用筛选出的菌种进行酸奶加工，验证其加工性能，掌握其工艺加工性能和应用于乳品加工的潜力，从而将其应用于乳品发酵产品，降低乳糖含量，缓解人体普遍存在的乳糖不耐症，扩大乳品的消费量。具有较高-半乳糖苷酶活性
16、的乳酸菌能将牛奶中的乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，这对于乳品行业的发展具有很大的应用潜力。此外，-半乳糖苷酶可被加工成液态、药剂或粉末状形式的产品，用来治疗乳糖不耐症。这些都为产-半乳糖苷酶的开发利用提供了潜在的发展市场。1.3 国内外研究现状和发展趋势历史上，-半乳糖苷酶的研究为微生物学的发展作出了巨大贡献。国外对-半乳糖苷酶的研究较早，许多研究工作主要集中在-半乳糖苷酶在食品加工中的应用。1889年，荷兰生物学家Beijerincek第一次报道了-半乳糖苷酶可水解乳糖。1944年Whitter1就比较全面的讨论了-半乳糖苷酶的应用。1948年Caputto2等讨论了通过大量培养和纯化脆壁酵母（
17、Saccharimyces fragilis）生产-半乳糖苷酶的方法。法国的雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）3通过对大肠杆菌-半乳糖苷酶的研究，于1961年提出了乳糖操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，使酶的生物合成可以按人们的意志加以调控，为研究其他生物的代谢调控提供了依据。1972年Rorglun等报道了真菌-半乳糖苷酶的特性。进入80年代，Jrodon等4首次对小鼠成功的获得了动物基因转移，是纯合子动物分泌的乳汁中完全不含乳糖，为利用基因工程生产低乳糖牛乳奠定了基础。国内对-半乳糖苷酶的研究起步较晚，是在20世纪80年代以后开始的。1980年天津工业微生物研究所5组成-半乳糖
18、苷酶研究组，对-半乳糖苷酶产生菌的选育、发酵工艺研究、酶的提取纯化、酶学特性的进行了较为全面的研究。1990年无锡轻工业大学的李强军等选育到黑曲霉菌CWL2NU-3，经发酵条件优化后产酶活力达12u/ml（ONPG单位）。1985年东北农业大学的万贤生对-半乳糖苷酶在乳清中的综合利用展开了研究。上海复旦大学的郭杰炎等以乳酸酵母Y12-1发酵生产的-半乳糖苷酶活力达40u/ml（ONPG单位），干燥制成的酶粉冰箱保藏半年，酶活残存98%。目前，-半乳糖苷酶主要用于低乳糖制品的研制和开发，以满足乳糖不耐症患者对乳制品消费的需求。工业生产上最直接、有效的方法就是将酶直接加入到牛乳中制得乳糖水解乳，该
19、法水解条件温和（pH3.88，温度5060），产物简单，不会破坏乳中的其他营养成分。国外已有一些大公司生产商业用乳糖酶制剂，用于生产乳糖水解乳制品。随着研究的不断深入，微生物发酵法生产的-半乳糖苷酶活性会进一步得到提高。如果在国内能够实现-半乳糖苷酶的工业化生产，其制品的生产和应用成本将会大幅度降低。因此，-半乳糖苷酶具有广阔的市场前景，并且会取得相当可观的经济效益和社会效益。1.4 -半乳糖苷酶的来源及其特性-半乳糖苷酶存在于植物（尤其是杏、桃、苹果），细菌（大肠杆菌、乳酸菌等），真菌（米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、热带假丝酵母等），放线菌以及哺乳动物（特别是婴儿）的肠道中。目前仅来源
20、于微生物的-半乳糖苷酶有工业应用价值，利用微生物发酵法制取-半乳糖苷酶，酶源丰富，产量高，生产成本低，周期短，而且不受季节、地理位置等因素的影响。不同微生物来源的-半乳糖苷酶的性质有所不同6。1.4.1 细菌产生的-半乳糖苷酶细菌-半乳糖苷酶，尤其是嗜热细菌产生的酶正得到广泛的研究，到目前为止，大肠杆菌（Escherichia coli）产生的-半乳糖苷酶是研究的最彻底、最深入，并已大量用于生化分析中。细菌产生的-半乳糖苷酶是胞内酶，在培养过程中不能分泌到培养基中，它的耐热性较高，这一点有利于固定化酶的制造。但因产量低及可能的毒性问题，故迄今未用于工业化生产。1.4.2 酵母菌产生的-半乳糖苷
21、酶酵母菌产生的-半乳糖苷酶通常是胞内酶，制备纯品必须破碎细胞，该酶对酸、热较不稳定，当某些离子存在时，才有最大活性，因此不适于在工业上进行应用。但是，酵母菌容易培养，在深层培养条件下可以大量生产-半乳糖苷酶，这些优点掩盖了它的不足，故酵母菌产生的-半乳糖苷酶才得以成功的进行开发。酵母菌产生的-半乳糖苷酶最适pH近于中性，与牛乳的天然pH值接近，最适温度较低，适于处理牛乳和甜乳清中的乳糖。脆壁酵母和乳酸酵母（Saccharimyces lactic）是生产-半乳糖苷酶的主要酵母菌种。1.4.3 霉菌产生的-半乳糖苷酶霉菌产生的-半乳糖苷酶是胞外酶，可以用固态培养也可以采用液态深层培养来生产，在培
22、养过程中酶分泌到培养基中，提取较为方便。霉菌产生的-半乳糖苷酶较耐热、耐酸，不需要活化剂和稳定剂，稳定性较高。M.S.Palunbo等人发现，米曲霉产生的-半乳糖苷酶即使在45高温下贮藏6个月，仍能保存其活力的93.4%。曲霉-半乳糖苷酶的最适pH值较低，适用于面包的制造以及分解面团中的乳糖，有利于酵母发酵，并使制品具有良好的色泽。同时，由于它较为稳定，有很好的耐受性，比酵母-半乳糖苷酶更适合于固定化酶的制造。目前应用较多的霉菌-半乳糖苷酶产生菌主要是米曲霉（Aspergillus oryzse）和黑曲霉（Aspergillus niger）。1.5 -半乳糖苷酶在食品工业中的应用1.5.1
23、水解牛乳和其它乳制品中的乳糖1.5.1.1 解决乳糖不耐症患者的乳品消费问题牛乳中含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素，尤其是牛乳中含有丰富的钙质，且极易被人体吸收，被誉为“近乎完善的食物”。但据有关资料报道，有10的白人，51的印第安人，81的非裔加勒人和70的亚洲人由于肠道内缺乏-半乳糖苷酶而患有程度不同的乳糖不适症(又称乳糖不耐症)7。用-半乳糖苷酶水解牛乳中的乳糖以满足乳糖不适症患者的需要，是较为实用、有效的方法。采用给患者同时服用乳制品和-半乳糖苷酶片(通常是霉菌-半乳糖苷酶，它的最适pH值与胃环境相一致)，也可以解决这一问题。1.5.1.2 提高乳制品的甜度乳
24、糖的甜度较低，只有蔗糖的20，水解后，一分子乳糖生成一分子葡萄糖和一分子半乳糖，可以明显提高乳制品的甜度，减少甜味剂的用量，而且不增加食品的热量8。1.5.1.3 防止乳制品冷冻时出现结晶乳糖的溶解度较低，只有蔗糖的10，在制作冷冻乳制品时容易结晶析出，影响产品质量。若在加工中添加2530的乳糖水解乳，可防止这类质量问题的出现9。1.5.1.4 在酸乳制作中的应用用-半乳糖酶水解乳制作酸乳比使用普通脱脂乳省时且节省蔗糖用量，而且能改善酸乳风味和口感，延长酸乳的货价期。1.5.1.5 在乳清加工中的应用乳清中含有乳清蛋白、乳糖、矿物质和维生素等营养成分，其中乳清蛋白是完全蛋白质。世界年产量约为9
25、107T，其中50当废水排放，不仅造成浪费，而且污染环境。用-半乳糖苷酶将乳清中的乳糖水解，可以提高含乳清饲料的营养价值，同时去除了乳清浓缩时乳糖结晶析出给饲料加工带来的不便。此外，用此水解物还可生产乳清饮料、糖浆、食品添加剂等10。1.5.1.6 在乳味面包中的应用在乳味面包制作中，添加-半乳糖苷酶水解乳，能够增加面包甜度，提高酵母菌产气量，使面包更加膨胀，而且水解乳中的半乳糖有利于褐变，改善面包色泽。1.5.2 生产低聚半乳糖(Galactooligosaccharide)低聚半乳糖是以牛乳或乳清中的乳糖为底物，经-半乳糖苷酶催化作用而得到的。低聚半乳糖的热稳定性较好，即使在酸性条件下也是
26、如此，并且具有许多生理功能，如作为双歧杆菌增殖因子；能促进钙质吸收和防止骨质减少；有利于促进有机酸生成，降低肠道pH值，抑制外源菌的生长代谢；有利于B族维生素产生；低能量；低致龋齿性；改善脂质代谢等11。1.5.3 分析食品中乳糖含量将精制的-半乳糖苷酶和其它酶(如过氧化物酶、葡萄糖氧化酶)联合使用可以分析冰淇淋、干酪和含牛乳的干制品中的乳糖含量。该法简便快捷，费用低廉，又可以在样品不除去蛋白的情况下使用，适合于在食品工业上进行应用12。1.5.4 -半乳糖苷酶在制药工业中的应用-半乳糖苷酶是酶类药物，适用于婴儿各种消化不良症，如先天性乳糖酶缺乏症、由胃障碍及缺铁所致的幼儿慢性腹泻、幼儿及新生
27、儿腹泻，由感冒及消化不良等引起的继发性腹泻。加入牛乳中则可防止由牛乳中乳糖不能吸收而引起的乳糖不耐症。1.5.5 -半乳糖苷酶在酶联免疫反应(EIA)中的应用-半乳糖苷酶经戊二醛一步标记抗人IgG，建立了ELISA测定程序，已用于人IgG、人群破伤风抗体、单克隆抗体检测，获得满意结果。同时用于孕酮、皮质醇半抗原标记，初步建立了该酶的液相竞争测定程序。近年来，又报道了合成该酶的大分子底物，因此，-半乳糖苷酶不仅可用作超微量荧光酶联分析，而且还可以在酶放大免疫测定（EMIT）和底物标记荧光分析中进行应用（SLFI-A）13。31东北电力大学学士毕业论文第2章 材料和方法2.1 材料2.1.1 材料
28、与试剂菌种来源：春光乳制品厂附近采集的土壤邻硝基苯-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）分析纯邻硝基苯酚（ONP）分析纯5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）分析纯二甲基甲酰胺（DMF）分析纯蛋白胨、乳糖、琼脂、酵母粉、NaCl 均为分析纯2.1.2 仪器与设备752型紫外/可见分光光度计 北京光学仪器厂HQZ-F全温振荡培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司LRH-250-II生化培养箱 广州医疗设备厂PB-10 pH计 Sartorius020 u m无菌滤器 SartoriuszC-10恒温水浴槽 宁波天恒仪器厂2.1.3 培养基分离选择培养基：蛋白胨2%，琼脂2%，X-gal 2
29、0mg/ml，酵母粉0.5%，乳糖2%，NaCl0.5%，蒸馏水100ml，pH7.37.5,121高压蒸汽灭菌1530min。液体发酵培养基：蛋白胨2%，酵母粉0.5%，乳糖2%，NaCl0.5%，蒸馏水200ml，pH自然。2.2 产-半乳糖苷酶菌的筛选2.2.1 菌株筛选方法 取土样，稀释10倍，置于80水浴锅中加热30min，以去除不产芽孢的菌体。摇床振荡，使土壤颗粒被打散，混合均匀，用无菌水将上述溶液稀释成10-3、10-4、10-5、10-6梯度，各取200L均匀涂布于乳糖筛选平板上， 3540培养2028小时。2.2.2 分离纯化培养后，挑取不同形态的蓝色菌落，通过平板划线进行分
30、离纯化，重复三次；对分离菌株进行培养形态观察和镜检，确定纯培养。2.2.3 菌种生理生化鉴定在细菌形态学鉴定的基础上，对所筛菌株进行初步的生理生化鉴定。2.2.4 -半乳糖苷酶粗酶液制备将纯化菌株按体积分数为1的接种量接种于液体发酵培养基中，37静置培养24h。将培养好的菌液以5000r/min离心10 min，弃掉上清液沉淀经预冷的磷酸缓冲盐溶液洗涤后，在冰浴中进行超声波破碎。裂解后的菌液在4下以12000r/min离心10min，收集上清液，即为粗酶液。2.2.5 邻硝基苯酚（ONP）标准曲线用柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液(pH6.8)配制 5mmol/ml 邻硝基苯酚（ONP）。取 7
31、 支试管分别吸取 0，0.01，0.02，0.03，0.04 ，0.05 ，0.10 ，0.15 ，0.20， 0.25，0.30 ，0.35，0.40 ，0.50，0.60mL 5mmol/ml ONP，补上述缓冲液至 0.5mL，然后 40保温15min，加入 2mL ，1mol/LNaCO3，以第一管为空白，于 420nm 测定吸光度，以 ONP 的量为横坐标，以 A420 为纵坐标绘制标准曲线。2.2.6 -半乳糖苷酶酶活力测定取0.1mL粗酶液与0.9mL浓度为0.01 mol/L邻硝基苯-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)的005 mol/L磷酸钠缓冲液(pH值为65)混匀，37 反应1
32、0 min后，加入1.5 mL浓度为0.4 mol/L的Na2CO3终止液静置5 min，于420 nm比色测定生成邻硝基苯酚(ONP)浓度。1个酶活性单位(u)定义为在37下每分钟分解出1mol ONP所需的酶量。2.3 -半乳糖苷酶酶学性质2.3.1 菌种生长曲线测定在筛选平板上挑一单菌落接种于装液量30 mL培养基的250 mL三角瓶中，37、225r/min恒温摇床培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、24、30、36、48、60h取样。每个处理重复3次。以未接种的基础培养液为空白对照。测定菌液的吸光度OD595 (即生物量)。以培养时间为横坐标；OD595为纵坐标绘制生长
33、物线。2.3.2 培养时间对菌株产酶能力的影响将种子菌液以2的比例接种到装有30 mL基础培养基的250 mL三角瓶中在37、225 r/min的条件下培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、24、30、36、48、60 h取样，每个处理重复3次，测定生物量和酶活性并绘制曲线。2.3.3 接种量对菌株BGJ222产酶能力的影响 将种子菌液以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的比例接种到装有30 mL基础培养基的250 mL的三角瓶中，于37 、225 r/min恒温摇床培养24 h取样测定-半乳糖苷酶表达量，每个处理重复3次。2.3.4 p
34、H值对-半乳糖苷酶活力和稳定性的影响测定-半乳糖苷酶粗酶液在不同pH值的浓度为0.05mol/L缓冲液中的酶活力，确定pH值对-半乳糖苷酶活力的影响。缓冲液分别为醋酸钠(pH值为4.5，5.0，5.5)、磷酸钠(pH值为6.0，6.5，7.0和7.5)和TrisHCl(pH值为8.0，8.5和9.0)，相对酶活用百分比来表示。将-半乳糖苷酶在上述缓冲液中37保温2 h和24h后，测残留的酶活力，分析pH值对-半乳糖苷酶稳定性的影响。2.3.5 温度对-半乳糖苷酶活力和稳定性的影响测定-半乳糖苷酶粗酶液在不同温度(温度范围为25-75)时的酶活力，确定温度对-半乳糖苷酶活力的影响。将-半乳糖苷酶
35、与浓度为0.05 mol/L磷酸钠缓冲液(pH值为6.5)混匀后，分别在30，40，50，和60保温4 h，每隔1 h测一次残留的酶活，分析温度对-半乳糖苷酶稳定性的影响。2.3.6 不同金属离子及离子浓度对-半乳糖苷酶的影响将-半乳糖苷酶与浓度为0.05 mol/L磷酸钠缓冲液(pH值为6.5)混匀，并添加各种不同的金属离子(K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+、Zn2+和Fe3+)，于37测定酶活。东北电力大学学士毕业论文第3章 -半乳糖苷酶酶学性质3.1 高产-半乳糖苷酶细菌的筛选用土壤为样本，以乳糖为唯一碳源，筛选出乳糖利用菌株。菌种纯化后测定其-半乳糖苷酶水
36、解活性，得到酶活较高的菌株8株。表1 列出了筛选获得的9株菌的-半乳糖苷酶水解活性的测定结果。表3-1 10株-半乳糖苷酶水解活性菌株编号特征描述OD420酶活（U/mL） 1乳白偏黄，半透明，边缘圆滑不规则，菌落中等大小0.8060.8242乳白色，几乎不透明，边缘圆滑，菌落很小0.1630.3483乳白色，半透明，边缘圆滑，菌落中等大小0.4030.6254乳白色，半透明，边缘圆滑，菌落很小0.5231.1155微红，半透明，边缘圆滑，菌落中等偏小0.2000.4256乳白色，半透明，边缘圆滑，菌落较大0.3060.6517玫瑰红色，不透明，边缘分枝状，菌落中等偏小0.2120.4528淡
37、黄色，半透明，边缘圆滑，菌落中等偏小0.2170.462从上表中可看出，1号菌株的酶活性最高，所以选择1号菌株作为实验用菌株。根据菌种的生理生化特点，初步判断其为枯草芽孢杆菌。3.2 邻硝基苯酚（ONP）标准曲线图3-2 邻硝基苯酚标准曲线Y7.823X+0.1576，R2=0.96923.3 菌株生长曲线测定由图3-3可见，单菌落生长经过6 h的迟缓期后，进入对数生长期，12 h后达到稳定期，生长到60 h后由于营养的耗尽以及环境pH变化和有毒代谢产物的大量积累，细菌生长进入衰亡期。对数生长期细菌代谢旺盛、酶活性高而且稳定，菌体大小比较一致。菌株的对数生长期为培养的第l0小时左右。因此，以下
38、试验均采用单菌落培养10 h的菌液作为种子菌液。图3-3 菌株生长曲线3.4 培养时间对菌株产酶能力的影响由图3-4可见，菌株在基础培养基中经过2 h的延缓期后进入对数生长期，经过4 h的对数生长后，进入平缓期。-半乳糖苷酶在菌株的对数生长前期表达量很低，进入平缓期后-半乳糖苷酶开始大量表达。培养24 h时-半乳糖苷酶的表达量达到高峰，为860，之后逐渐下降，整个过程呈现出典型的“S”型。所以，在以下试验，培养时间均设定为24 h时取样。图3-4 培养时间对菌株产酶能力影响3.5 接种量对菌株产酶能力的影响由图3-5可见，随着接种量的增加，-半乳糖苷酶表达量逐渐增加，接种量为2.0时达到最高以
39、后又随着接种量的增加-半乳糖苷酶表达量逐渐降低。接种量太小，菌的生物量不足，对产酶不利，接种量太大，营养不足，同样会影响酶的表达量。所以接种量为2.0效果最佳。图3-5 接种量对产酶能力的影响3.6 pH对酶活性和稳定性的影响pH值对酶催化反应的影响分别为影响酶催化底物转变成产物效率以及酶的稳定性。在pH值为4.59.0范围内测定-半乳糖苷酶的活性，结果如图3-3-1所示。由图3-3-2可以看出，-半乳糖苷酶的最适pH值为6.5。当pH值为6.5时。-半乳糖苷酶37保温24 h后仍有80的活力。因此-半乳糖苷的最适酶活力和稳定性皆是pH值为6.5。图3-6-1 pH对酶活性的影响图3-6-2
40、pH对酶稳定性的影响3.7 温度对酶活性和稳定性的影响从图3-7-1可以看出，酶的最适温度在35左右，40时仍能保持90%以上活力，40之后酶活开始下降，60时只剩30%左右。由图3-7-2可以看出，在30 和40时，保温处理4 h后仍有85酶活力。图3-7-1 温度对酶活的影响图3-7-2 温度对酶的稳定性的影响3.8不同金属离子及离子浓度对-半乳糖苷酶的影响同金属离子及离子浓度对-半乳糖苷酶的影响结果如表3-8所示。由表3-8可以看出在各种金属离子中，K+、Na+、Mn2+和Mn2+在适当浓度范围内对-半乳糖苷酶酶活有促进作用，但随着浓度增加，促进作用减弱或变成抑制，其中Mg2+对-半乳糖
41、苷酶活力的促进效果最明显，当添加浓度为10 mmol/L的Mg2+时，酶活力达到112.24。Fe2+、Fe3+、Ca2+、Zn2+和Cu2+对-乳糖苷酶酶活有抑制作用，且随浓度增加抑制作用加强，其中Cu2+的抑制作用最强。在反应液中加入浓度为1mmol/L Cu2+后，-半乳糖苷酶即失去活力。表3-8 金属离子对酶活性影响试剂相对酶活100%1mmol/L10mmol/L100mmol/L空白对照100.00100.00100.00Fe3+84.8613.45ndFe2+86.7835.758.47K+108.12110.2196.23Na+100.46106.7896.00Mn2+110.
42、1255.1410.12Mn2+107.23113.57100.74Ca2+90.1242.45ndZn2+65.81ndndCu2+ndndnd注：nd表示酶的相对活性低于5%，可忽略不计。第4章 酶的固定化研究4.1固定化酶简介酶是由生物体产生的具有催化活性的蛋白质，它能特定地促成某个化学反应而本身却不参加反应，具有催化效率高，条件温和，反应产物污染小，能耗低，反应容易控制等特点。这是任何无机催化剂都无法比拟的优点。但因为酶的化学本质是蛋白质，其最大弱点是不稳定性，对酸、碱、热及有机溶液容易发生酶蛋白的变性作用，从而降低或失去活性。而且酶往往在溶液中进行反应，反应以后会残留在溶液系统中不易
43、回收，造成最终产品生化分离提纯操作上的麻烦。加之酶反应只能分批进行，难于连续化、自动化操作。这大大地阻碍了酶工程的发展应用。为克服上述缺点，要将游离酶固定化后进行应用。固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在特定的载体上。由于固定化酶的运动被化学或物理的方法限制了，能将其从反应介质中回收，所以它原则上能在批量操作或连续操作中重复使用。固定化酶是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。固定化酶是近十余年发展起来的酶应
44、用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景14。固定化酶的研究始于 1910 年，正式研究于 20 世纪 60 年代，70 年代已在全世界普遍开展。酶的固定化 (Immobilization ofenzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃，得到迅速发展和广泛的应
45、用，而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。4.2 酶的固定方法4.2.1 包埋法载体(如聚丙烯酰胺凝胶、矽酸盐凝胶、藻酸盐、角叉菜聚糖等)在有酶的存在下发生聚合、沉淀或凝胶化。此法最简单，但固定后的酶活力不高，固定酶的牢度不强。4.2.2 吸附法通过非特异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将酶固定到载体(如硅藻土、陶瓷、塑料等)表面，方法简便，酶活力不受影响，但是吸附的静电作用力容易受到反应液中pH的影响。4.2.3 吸附法通过非特异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将酶固定到载体(如硅藻土、陶瓷、塑料等)表面，方法简便，酶活力不受影响，但是吸
46、附的静电作用力容易受到反应液中pH的影响。4.2.4交联法交联法又称为架桥法，是借助于双功能或多功能试剂与酶分子中的氨基或羧基发生反应，使酶蛋白分子之间发生交联，结成网状结构而制成固定化酶。最常用的交联试剂是戊二醛。与共价结合法一样，由于酶的功能团(如氨基、巯基和咪唑基)参与反应可能引起酶活性中心结构的改变，使酶活力下降。虽然固定化方法及固定化载体较多，并用于多种酶，但是迄今为止，几乎没有一种固定化技术或载体能普遍适用于每一种酶，因为各种酶的化学特性和组成差别很大，底物和产物性质不同，产物的用途也不一样。因此，对任何一种酶的固定化，其载体和方法的选择都更多的依赖实验结果。根据酶的特殊性和应用目的(如工业生产、医学应用或是生物学模型系统)，可以从许多方法中选择。表4-2为各种酶的固定化方法比较：表4-2 固定化方法及优劣比较方法优点缺点吸附法制作条件温和、简便、成本低、可再生、可反复利用结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小包埋法包埋材料、包埋方法可选择余地大，固定化酶的使用面广，包埋条件温和仅可用于低分子量的底物，不适用于
