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1、第二章 生物技术在水稻育种中的应用,主要内容,第一节 组织培养技术在水稻育种中的应用第二节 无融合生殖的应用 第三节 分子标记辅助育种 第四节 转基因技术的应用 第五节 存在问题及对策,第一节 组织培养技术在水稻育种中的应用,一、花药和花粉培养的应用 二、体细胞培养及细胞突变体的筛选 三、原生质体融合与体细胞杂交,一、花药和花粉培养的应用,1、研究进展2、与常规育种相比，具有优点3、花药培养程序,一、花药和花粉培养的应用,1、研究进展 1964年 Gula 首次报道毛叶曼陀罗花培成功。1968 年新关和大野获得了粳稻花培小植株。我国水稻花培育种始于 1970 年,1975 年首次应用此法育成水
2、稻新品种“单丰1 号”、“花育1 号”、中花8号等。,一、花药和花粉培养的应用,2、与常规育种相比，具有优点：（1）缩短杂交育种年限常规育种 一般要 810 年（2）提高了选择效率 来自于小孢子的双单倍体花粉植株的表现型和基因型一致,没有显性基因对隐性基因的掩盖现象。,一、花药和花粉培养的应用,3、花药培养程序（1）取材 品种（基因型)粳籼粳稻籼稻（2）预处理 低温冷藏 10oC下2-3周（3）消毒 漂白粉饱和液上清液 0.1%升汞（4）接种（5）培养 N6或MS培养基，2，4-D诱导（6）单倍体植株的移栽,二、体细胞培养及细胞突变体的筛选,1、概念 在细胞水平上直接进行诱变与筛选突变体的研究
3、。,二、体细胞培养及细胞突变体的筛选,2、诱变剂种类和材料：（1）诱变剂种类化学诱变剂 甲基磺酸乙酯（EMS)、亚硝基胍（MNNG)物理诱变 射线处理（2）材料游离的植物细胞、原生质体或小孢子的群体,二、体细胞培养及细胞突变体的筛选,3、应用：目前用这种方法已筛选到抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的突变体,有些已用于生产。例如 陈受宜 EMS诱变和盐胁迫反复筛选得到稳定的9代粳稻突变体，采用130个标记作探针对突变体作RFLP分析，发现了第7染色体两个突变位点（RG711和RG4）。,三、原生质体融合与体细胞杂交,1、概念 原生质体融合又称为细胞杂交，指植物原生质体，在人为的条件下互相融
4、合，获得细胞杂种植株。分为三类：体细胞杂交；配子间细胞杂交；配子-体细胞杂交。,体细胞杂交概念,体细胞杂交是用双亲的体细胞原生质体或其衍生系统进行诱导融合，再经培养、筛选、鉴定、等步骤得到细胞杂种。,三、原生质体融合与体细胞杂交,2、优点（1）克服了远缘杂交不亲和性（2）扩大植物的变异范围，拓宽种质来源，选育出新种质，,三、原生质体融合与体细胞杂交,3、水稻上的应用 栽培稻品种之间、栽培稻与野生稻之间的原生质体融合已有报道。融合方式 对等的融合和不对称融合 化学诱导融合和电激融合 PEG(聚乙二醇)融合中以丙酸钙取代氯化钙,第二节 无融合生殖的应用,1、研究进展20 世纪70 年代 利用无融合
5、生殖固定水稻杂种优势1987 年,袁隆平，三系法到两系法,最后实现一系法,2、发展方向 多倍体水平，即在多倍体水稻中通过种质寻找法、种质诱变法、杂交转育法、生物技术筛选等创造具有实用价值的水稻无融合生殖种质。,第三节 分子标记辅助育种,一、遗传图谱的构建二、亲缘关系分析三、农艺性状的定位四、其他,一、遗传图谱的构建,水稻第一张分子图谱由美国 Cornell 大学 Tanksley 实验室发表,目前该图谱已有标记 700多个,其中绝大部分是 RFLP标记,有11 个微卫星DNA标记、26 个克隆基因和43 个表型性状。日本也发表了水稻分子图谱。高密度分子图谱的建成为基因定位、物理图谱的构建和依据
6、图谱的基因克隆奠定了基础。我国已在世界上首次成功地构建了高分辨率水稻基因物理图谱,这必将对水稻生物技术的发展产生深远影响。水稻被定位标记数目已多达 1100 多个,而且平均分布于每条染色体上近100 个,这样高密度的图谱为水稻的标记辅助选择提供了极为有利的条件(Kurata et al,1994)。,二、亲缘关系分析,1、优点：在分子图谱的帮助下，提高了对品种之间的比较结果的可靠性。2、应用：品种资源的鉴定与保存、探究作物的起源与进化、杂交亲本的选择等等。例如;Wang 和 Tanksley 应用10 个 RFLP标记,对70 个水稻品种进行了亲缘关系分析。品种间多态性的检测是选择合适亲本、构
7、建分离群体、进行基因定位的基础。,三、农艺性状的定位,在水稻中,已经定位了多种重要农艺性状,包括抗稻瘟病基因、抗白叶枯病基因、抗白背飞虱基因、广亲和基因、光敏雄性不育基因等等。水稻许多经济性状为数量性状,这些性状受数量性状坐标(QTL)的控制,而且环境条件对它有较大的影响,因此,这些性状的定位比较困难。例如：Wang等在一个重组自交系中鉴定了10 个与稻瘟病部分抗性有关的QTL。国内徐云碧等、林鸿宣等对水稻有关形态及产量性状组成因子进行了QTL 分析。,四、其他,预测杂种优势、加速回交育种进程、克服不利连锁选出理想重组个体、分析植物遗传多样性等方面还可用于遗传指纹的绘制,从而获取有关基因数目、
8、作用与效应等方面信息,为基因克隆提供基础。此外,它在基础材料或当选群体的检测、评价与处理等方面都尚有进一步探索与发掘的余地。,第四节 转基因技术的应用,一、抗病虫性的改良二、抗逆性改良三、品质性状改良四、抗除草剂五、外源基因导入技术,一、抗病虫性的改良,1、抗虫性 水稻品种资源中,对白背飞虱、螟虫、稻纵卷叶螟粘虫、麦蛾苏云金芽孢杆菌的Bt 杀虫晶体蛋白蛋白酶抑制剂基因,一、抗病虫性的改良,2、抗病性 将来自野生稻的 Xa21 基因和来自昆虫的抗菌肽基因导入水稻,提高了水稻对细菌性病害如白叶枯病的抗性;将来自葡萄的植物抗毒素基因导入水稻,提高了水稻对真菌性病害如稻瘟病的抗性;在抗病毒病方面,以转
9、移病毒外壳蛋白(CP)及复制酶基因的技术路线较为成功。,二、抗逆性改良,1、耐淹性 Hossan 等已分离克隆出 3 个与水稻耐淹能力有关的基因pdc、pdc、pdc,并采用不同的启动子将上述基因转入水稻基因组中,获得了耐淹的转基因植株;,二、抗逆性改良,2、耐盐性 日本植物工程研究所、名古屋大学的高倍铁子等成功地将编码大肠杆菌的甜菜碱生物合成酶基因 betA导入水稻中,获得了耐盐的转基因植株。,二、抗逆性改良,3、耐旱性 Rathinasabathi 等将烟草中的 CMO 基因导入水稻中,以期获得抗旱性较强的转基因水稻。许德平等则将大麦后期胚胎富蛋白基因HVA1 导入水稻,以求提高水稻的抗旱
10、能力。,三、品质性状改良,1、脯氨酸 利用遗传工程进行水稻品质改良主要是改良营养品质,Meijer 等将分离克隆出的富脯氨酸基因成功地导入水稻基因组中,获得了转基因植株。,三、品质性状改良,2、甲硫氨酸和赖氨酸 Eunpyo 将人工改造的水稻储藏蛋白基因 Glutelin(富含甲硫氨酸和赖氨酸)导入水稻中,获得了再生植株,并发现其能表达 Glutelin蛋白。,三、品质性状改良,3、类胡萝卜素 Barkharddt 等将单子叶植物中的八氢番茄红素合成酶及其脱氢酶基因导入水稻基因组中,获得了富含类胡萝卜素的再生植株。,三、品质性状改良,4、高蛋白 将大豆、高粱、玉米的DNA 导入水稻品种,后代分
11、离出蛋白质含量高的单株。,四、抗除草剂,成功获得抗除草剂转基因水稻的报道最多。用抗除草剂的外源基因转化杂交水稻的恢复系或 将此基因转育到恢复系,此种恢复系用来制种,得到的下一代将表现抗除草剂。优点：（1）解决杂交稻制种纯度不稳定的问题。（2）用抗除草剂基因转化的水稻品种用于直播,也将方便田间杂草的防除,为直播稻的栽培管理找到了简便有效的方法。,五、外源基因导入技术,1、PEG 介导转化技术2、电注射技术3、基因枪转化技术4、农杆菌转化技术5、花粉管通道技术6、穗茎注射技术7、种胚浸泡技术,四、外源基因导入技术,1、PEG 介导转化技术 PEG 技术是将原生质悬浮于含有DNA 的溶液中,用分子量
12、为4 000 6 000 的PEG(聚乙二醇)在pH8 9下,促进DNA 的提取,从而使细胞实现遗传转化。例如：康乃尔大学的吴瑞研究室应用PEG 介导技术将g us 基因导入到水稻原生质体中,并得到了转化植株。,四、外源基因导入技术,2、电注射技术 电注射技术是通过高强度电脉冲的刺激,使原生质体膜具渗透性,从而使外源DNA 进入原生质体。例如，1998年,Kinya 等以原生质体为外源DNA 的受体,通过电注射技术将携带有新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的质粒DNA 导入水稻原生质体中,然后通过看护培养技术从处理的原生质体再生出了转化植株。,四、外源基因导入技术,3、基因枪转化技术 基因枪转
13、化技术的优点是免去了分离原生质体的麻烦,可以直接转化多种组织或器官,细胞。例如：Christcu 等采用基因枪转化技术获得具有带双丙氨酰磷抗性基因(bar)的转基因水稻植株。,四、外源基因导入技术,4、农杆菌转化技术优点:（1）转化率高,再生植株的可育率高;（2）可转移较大片断的外源DNA,不需要原生质体培养;（3）导入的外源基因拷贝数较低。,四、外源基因导入技术,5、花粉管通道技术 该技术是利用受体颖花开花授粉后,在花粉管伸长过程中,珠心的部分细胞开始退化,形成了花粉管通过珠心进入胚囊的通道,在花粉管道形成之后和封闭之前一段时间,使外源DNA 进入胚囊,被转化的受体细胞壁尚不完整的卵细胞、合
14、子或早期胚胎细胞,实现其遗传转化。例如：广西农科院品种资源所采用花粉管通道技术导入外源DNA 育成了水稻新品种桂D1 号。,四、外源基因导入技术,7、种胚浸泡技术 种胚浸泡技术是利用外源DNA 溶液浸泡干种子胚或萌动种子胚芽,使外源DNA 进入并转化分裂旺盛的茎端分生组织细胞,实现其遗传转化。,四、外源基因导入技术,6、穗茎注射技术 穗茎注射技术是利用禾谷类作物孕穗期(小孢子减数分裂前后),将外源DNA 注入到穗茎节或穗茎节下部茎腔中,外源DNA 通过受体植株的输导组织进入生殖细胞,实现其遗传转化。,第五节 存在问题,一、存在问题二、对策,一、存在问题,1、转化技术不完善2、组织培养过程引起遗
15、传变异3、外源基因的位置效应4、外源基因失活5、转基因水稻的安全性问题6、杂交稻的特性7、知识产权限制,一、存在问题,1、转化技术不完善1)农杆菌介导转化方法不能用于亚种内的各品种，这主要是由于:所建立的转化体系仅仅是针对某些品种,且多为模式品种,更换材料后,所建立的体系不一定有效;农杆菌的侵染存在基因型的差异,影响转化效率;组培方法也高度依赖于水稻基因型。2)现有的转化体系还存在着转化频率低,转化结果不稳定等因素,难以获得大量的转化植株,而无一定数量的转化植株的保证,转基因水稻育种工作是无法开展的。,一、存在问题,2、组织培养过程引起遗传变异例如:不育、矮化、早熟、白化等,这些变异频率往往达
16、30%以上。,一、存在问题,3、外源基因的位置效应 由于外源基因插入的“位置效应”,导致外源基因的表达水平在不同转化体之间产生极大差异,“位置效应”极其不利于筛选外源基因高效表达的转基因植株。,一、存在问题,4、外源基因失活(1)外源基因的拷贝数的增加(2)发生DNA 甲基化(3)基因沉默,一、存在问题,5、转基因水稻的安全性问题 转基因食品携带的选择标记基因如抗生素抗性基因和抗除草剂基因.,一、存在问题,6、杂交稻的特性（1）如何控制与保证外源基因在水稻杂交种中稳定高效地表达,（2）如何调控多个外源基因在受体植物中高效协调地表达,同时又能在父母本中互补性地联合使用不同的外源基因。,一、存在问题,7、知识产权限制转基因水稻新品种(组合)商业化。,二、对策,1、充分考虑水稻起始材料的育种价值2、完善水稻转基因技术方法3、开展规模化的水稻转基因研究4、加强转化体的检测及选择5、与常规育种密切结合6、扩展研究领域 使用具有自主知识产权的基因和转基因方法7、重视转基因水稻安全性问题8、加强自主知识产权的保护9、转基因水稻育种与产业化,总结,
