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1、菜花、肝脏DNA的提取及琼脂糖凝胶检测,一.实验目的,学习DNA提取的原理及方法。掌握琼脂糖凝胶电泳的操作方法。运用琼脂糖凝胶电泳检测DNA。,二.实验原理,1核酸分离提取的原则 1）应保证核酸一级结构的完整性 2）排除其他分子的污染 A 核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶 剂和过高浓度的金属离子 B其他生物大分子如：蛋白质，多糖和脂类分子 的污染应降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染（如：提取DNA分子 应除去RNA；反之亦然）,2.核酸提取的步骤1）破碎细胞（材料不同，方法不同）匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。2）除杂质，提DNA 杂质：蛋白，多糖，脂类，DNase,RNas
2、e A.DNase的抑制 DNase需Mg2+,Ca2+激活，所以提取时加EDTA或EDTA钠盐。（螯合金属离子）加去垢剂或变性剂（SDS），可使DNase变性失活 B.除RNA 酶法：加RNase,调节pH：RNA能在室温条件下被稀碱水解成核甘酸而DNA对碱较稳定，所以提DNA一般要在偏碱的环境中提取，提RNA要在偏酸的环境中稳定。如提植物DNA一般要加Tris-酚（pH8.0），提RNA加水饱和酚（酸酚）（pH5.8）。调节盐浓度(盐的分步沉淀)：在浓NaCl（12M）溶液中，DNA溶解度大，RNA溶解度小；在稀NaCl（0.14M）中，DNA溶解度小，RNA溶解度大，因此可利用不同浓度的
3、NaCl溶液将DNA和RNA从样品中分开。,C.除蛋白加去垢剂或变性剂（SDS，十二烷基硫酸锂LDS，十二烷基肌酸钠，脱氧胆酸钠）使蛋白变性，与DNA分开；用有机溶剂沉淀，除去蛋白常用的有机溶剂：苯酚，氯仿，异丙醇，醚等本次实验所用：氯仿：异丙醇24：1 氯仿：使有机相和水相易分层，增加核酸得率，同时可除去脂类。异丙醇：可减少泡沫，也能促使有机相，水相分离。,D.除糖，脂类 对于含糖量高，含脂高的样品需要做 3.DNA提取注意事项减少物理因素对DNA的降解。动作轻柔缓慢，尽可能不要剧烈振荡或搅拌，除破碎细胞，使DNA和蛋白分开时6070水浴外，其余操作尽可能在冰浴上进行。用枪吸核酸时最好用1m
4、l的枪和枪头，枪头必要时可用剪刀剪去一段，防止枪头对DNA造成机械损伤。,加蛋白水解酶：如提动物组织中的DNA，常加蛋白酶 K,三.实验试剂,1，5mol/L NaC溶液;2，0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na溶液;3，25%SDS 溶液；4，24:1 氯仿异戊醇混合液；5，3mol/L 乙酸钠0.001mol/L EDTA-Na溶液；6，95%乙醇；7，10 X TBE;8，EB（溴乙啶）;9，溴酚蓝指示剂,四.实验步骤,（一）DNA提取1，称取 肝脏或者菜花5g,用水清洗后，加入石英砂(半匙)研磨,再加入14ml 0.14M NaCl-0.15M EDTA溶液
5、，继续研磨至浆状，分装两管，平衡后对角线放入离心机，4000 rpm离心10 min，所得沉淀即为核糖核酸粗制品2，上述沉淀物加入0.14M NaCl-0.15M EDTA溶液ml，再加入25%SDS 0.6 ml（分开两管），60保温10 min（不停搅拌）至溶液变粘稠。3，上述溶液倒入研钵中，加入 NaCl溶液ml，搅拌10 min，再加入氯仿异戊醇10 ml，轻轻搅动15 min，分装两管，4000 rpm离心10 min，取上清液(注意：不要取到中间的蛋白质和下层的有机相）。4，上清液加入1ml乙酸钠-EDTA溶液，加入1.5倍体积的95%冰冻乙醇，用玻棒慢慢搅拌，可看见DNA缠绕在玻
6、棒上5，加100ul-200ul水溶解DNA。,（二）琼脂糖凝胶法检测DNA,琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比。,2.溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min.琼脂糖凝胶EB
7、染色，则肉眼可见核酸电泳带.,2.设备与试剂,琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE（0.08mol/l TrisHCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/l EDTA）,3.凝胶制备,用上述缓冲液配制1%琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5g/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待胶凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶
8、浸没在缓冲液下1mm处。,4.样品制备与加样,5ul的样品中加入5ul上样缓冲液：含指示染料（0.025溴酚蓝或桔黄橙）、蔗糖（10-15）或甘油（5-10），也可使用2.5Fico 增加比重，使样品集中，每齿孔可加样10ul(5-10ug),5.电泳,一般电压为5-15V/cm,根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳(本次实验用100V，70mA，2040min),提取完好的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱,未除去RNA的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱,五.实验结果,六、实验结果分析讨论七、思考题1，写出本次实验中提取DNA时每一步操作中所用试剂的目的。2，查阅相关资料，写出至少一种其它方法提取DNA的原理及步骤,
