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1、第六章 食品的卫生细菌学检验,第一节食品中菌落总数的测定,一、菌落总数,是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后,所得1mL(g)或1cm2面积检样中所含菌落的总数。,二、菌落总数测定的意义,1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2、预测食品存用的期限长短。3、了解细菌在食品中的繁殖动态。,三、菌落总数测定的方法,平板倾注法平板表面涂布法平板表面点滴法,四、平板倾注法测定菌落总数,检验步骤(程序)：检样稀释处理做平板培养菌落计数报告结果,（一）、样品稀释及做平板,1ml,1ml,1ml,1ml,1:10,1:1000,1:100,1:10000,1ml,1ml,1ml,加入46营养琼脂121
2、5ml,25g/ml样品,生理盐水,检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。,（二）培养,普通食品:37 48h 倒放平板清凉饮料、调味品、糕点、酒类：37 24h 水产品:30 48h,（三）计数和报告,到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。,1、菌落的选择,（1）、单个菌做一个菌落计（2）、呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。（3）、如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。,2、
3、平板菌落计数的选择,（1）、选取菌落数在30300之间的平板（SN标准要求为25250个菌落），若有二个稀释度均在30300之间时，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字。,（2）、如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告（3）、如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告（4）、如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告（5）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。,3、菌落数的报告,菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数
4、按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。,(四)、检验注意事项,1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；3、吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm,调整时要使管尖与容器内壁紧贴;4、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触;,5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min.6、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。,复习题,1、什么是菌落总数？2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意义？
5、3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。4、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？,第二节 食品中大肠菌群的检验,一、大肠菌群,1、什么是大肠菌群？指一群需氧及兼性厌氧，在37能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。2、大肠菌群的组成:大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。,1、粪便污染的指标菌：大肠菌群或大肠杆菌,二、大肠菌群的测定意义,2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因,在粪便中数量最大；在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；检测方法简便容易。,3、大肠菌群
6、的测定意义（1）、判断食品中否受到粪便污染。（2）、有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）、有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。,三、大肠菌群的生物学特性,1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气 3.培养特性：在琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。,EMB平板照片及原理,麦康凯琼脂平板Age of culture is 24 h,大肠杆菌平板菌落照片,肠杆菌扫描电镜照片.,四、大肠菌群检验方法及操作方法,国家标准：三步法：乳糖
7、胆盐发酵试验分离培养证实试验(乳糖发酵试验)行业标准：两步法：推测试验证实试验,检样,稀释处理,EMB等,革兰氏染色,乳糖发酵管,革兰氏阴性无芽胞,产气,革兰氏阳性,大肠杆菌阴性,大肠杆菌阴性,报告,不产气,乳糖胆盐发酵管,产气,不产气,大肠杆菌阴性,报告,报告,报告,大肠杆菌阳性,1:100,1:10,各加入1ml,各加入10ml,各加入1ml,单料乳糖胆盐发酵管,单料乳糖胆盐发酵管,双料乳糖胆盐发酵管,初发酵,检样稀释,检样量1g/ml,检样量0.1g/ml,检样量0.01g/ml,EMB,分离培养,证实试验,乳糖发酵管,镜检,查MPN表报告结果,表1 粪大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落
8、特征,MPN法简介The Most Probable Number Method,1g/ml检样中最近似值(MPN)表,以1、0.1、0.01、各用3管。,五、粪大肠菌群的检验,粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。,检验方法,检样,产酸产气,查MPN表报告,EMB 分离靛质基试验,阳性反应,方法一：,45 EC肉汤发酵,稀释,44乳糖胆盐发酵,方法二：,检样,稀释,36乳糖胆盐发酵,产酸产气,产酸产气,EMB 分离,查MPN表报告,1、从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。2、对产酸但未看到气泡的
9、乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。3、挑选菌落进行证实试验时，最少要挑2个以上的典型菌落或非典型菌落进行接种。4、不可用其他胆盐代替指定的胆盐。,六、检验注意事项,EMB平板照片及原理,靛基质试验原理及照片,七、大肠菌群快速检验,食品大肠菌群快速检验方法：TTC显色法；DC试管法；纸片法。,（一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片,使用方法：1.样品稀释同国标法2.接种：饮料和饮用水采用原液、1:10、1:100三个稀释度，固体食品采用1:1、1:10和1:100三个稀释度。用1亳升灭菌吸管吸取1亳升同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重
10、复。,3.培养：将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在36下培养1524h观察结果。4.结果判定:纸片上出现紫红色斑点,其周围有黄圈者,为阳性.纸片为一种着色,无菌落生长者为阴性.纸片呈紫兰色,有紫红色斑点，其周围地黄圈者阴性.酸性食品接种后,纸片变黄,经培养后无紫红色斑点为阴性,（二）餐具大肠菌群快速检验(纸片法),使 用 方 法：1.采样610份。碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内侧表面，30秒后取下，置于原塑料袋内。筷子以5只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）抹拭两张，放入原塑料袋内。,2.将已采样的纸样置于37C培养1
11、5小时.纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为合格。,食品冷饮大肠菌群检验纸片冷饮、乳制品和调味品等大肠菌群的测定,食品饮料大肠菌群快速检验纸片饮料、食用纯水和糕点的大肠菌群测定,餐具大肠菌快速检验纸片餐具卫生消毒效果检测,大肠菌群测试片适用于需要对大肠菌群准确计数的样品，如消毒牛乳、冷饮和调味品等。,八、水的大肠菌群检验,（一）、水样的采集,1、自来水（未含氯）：龙头火烧灭菌，畅流510后取样。2、地面水源水：江湖河，水库，水池等。浸入水下20cm下取样。水井50cm下取样。3、漂白粉处理的水样：自来水
12、，游泳池水，应在瓶内加入0.03g硫代硫酸钠/500ml，或2ml 1.5%硫代硫酸钠液/500ml，除氯。4、运送：2小时内送到检验室。610，6h,立即检验.5、检验前：将水样振摇510分钟。,（二）、生活饮用水或食品生产用水的检验（大肠菌群）,各加10ml,各加100ml,水样,初发酵,三料乳糖胆盐50毫升装,三料乳糖胆盐5毫升装,EMB分离,36培养 24h,复发酵,乳糖发酵,镜检,36培养 24h,大肠菌群检索表（饮用水）,（三）、瓶装矿泉水的检验（大肠菌群）,原水样,双料乳糖胆盐发酵管10毫升装,37培养 24h产酸产气者,亮绿乳糖胆盐发酵管,37培养 48h产酸产气者,查表报告,
13、各加入10ml水样,矿泉水的检验检索表,(四)、水源水的检验,接种量严重污染水：1、0.1、0.01、0.001ml各1份 总量：1.111ml中度污染水：10、1、0.1、0.01ml各1份 总量：11.11ml轻度污染水：100、10、1、0.1ml各1份 总量：111.1ml,原水样,接种量100ml用三料乳糖胆盐接种量10ml用双料乳糖胆盐接种量1ml用单料乳糖胆盐,EMB分离,乳糖发酵,复发酵,36培养 24h,36培养 24h,查表报告,镜检,复习题,1、什么是大肠菌群？大肠菌群由哪些微生物组成？2、测定食品、饮料等产品的大肠菌群数有什么意义？3、大肠菌群具有哪些生物学特性？4、在大肠菌群数的检验中，要注意哪些事项？5、在水的大肠菌群数检验中，如何进行水样的采集？,
