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1、宁夏医科大学硕士研究生学位论文血浆OPN和TAT水平检测在非小细胞肺癌中的临床意义研究生姓名： 指导教师： 研究方向： 学科专业：呼吸内科论文完成日期：二一年三月Ningxia Medical universityThesis for Application of Mas ter DegreePlasma levels of TAT and OPN in Non-small Cell Lung CancerStudent Name:Director:Specialty: lung cancerMajor:Respiratory MedicineFinish Date:Apr. 2010宁夏医科
2、大学硕士研究生学位论文 目录目录中文摘要Abstract符号说明前言血浆OPN和TAT水平检测在非小细胞肺癌中的临床意义材料与方法结果结论讨论参考文献发表论文和参加科研情况说明综述血浆OPN和TAT水平检测在非小细胞肺癌中的临床意义综述参考文献致谢壹宁夏医科大学硕士研究生学位论文 摘要血浆OPN和TAT水平检测在非小细胞肺癌中的临床意义摘要肺癌(Lung cancer)是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其中以非小细胞肺癌（NSCLC Non-small Cell Lung Cancer ）为主要病理类型，占到80%。患者常伴有凝血异常，分期是判断预后的主要指标之一，研究表明，OPN（骨桥蛋白）在多
3、种恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等组织表达及血浆水平均有增高，并且对判断肿瘤的浸润、转移和预后，指导临床诊断和治疗有重要意义。 而被凝血酶裂解的OPN生物性能会有所改变，在肿瘤组织表达会更加明显。上述报道大多局限在对肿瘤组织的研究，而联合检测外周血中OPN、TAT含量与肿瘤的关系，尤其在肺癌诊治中的应用研究报道较少。而检测外周血中的OPN、TAT具有简单、快捷和无创的优点。本研究通过检测外周血中的OPN、TAT水平，探讨两者在非小细胞肺癌的诊断、治疗、预后判断中的作用。目的：通过检测骨桥蛋白（OPN）、凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）在非小细胞肺癌（NSCLC）血浆中水平的并将二者进行相
4、关性分析，探讨二者在非小细胞肺癌（NSCLC）临床意义。方法：:收集临床确诊的46例NSCLC、22例肺部良性病变患者及20例健康体检者血浆，采用酶联免疫吸附测定法(ELASA)检测NSCLC患者及对照组的血浆OPN及TAT 水平，并应用 SPSS11.5统计学软件进行统计学分析，对各组数据进行差异性比较和相关性分析。结果：（1）OPN在NSCLC血浆水平明显高于肺部良性病变患者及健康体检者(p=0.017,t=7.376);TAT在NSCLC血浆水平明显高于肺部良性病变患者及健康体检者(p=0.000,t=15.885)；（2）OPN、TAT血浆水平在肺部良性病变患者及健康体检者之间对比,差
5、异无统计学意义（P0.05）；（3）OPN、 TAT血浆水平与肺癌分期、远处转移明显相关，而与性别、年龄、病理类型无关；(4) NSCLC患者 OPN、 TAT血浆水平呈正相关（r=0.502，p 0.05); (3) OPN, TAT plasma levels and lung cancer staging, distant metastasis significantly related, but not related with gender, age, pathological type ; (4) NSCLC patients with OPN, TAT plasma levels
6、 were positively correlated (r = 0.502, p 0.05). Conclusions: (1) in peripheral blood levels of OPN and the TAT to reflect the bodys tumor burden in patients with NSCLC state; (2) NSCLC patients with peripheral blood levels of OPN and the TAT and gastric cancer invasion, metastasis; (3) OPN, and TAT
7、 NSCLC may be the occurrence and development play a synergistic role in the process; (4) detection in peripheral blood OPN, TAT, in particular the joint detection of two pairs of NSCLC diagnosis, treatment and prognosis have some clinical significance. TAT, OPN can be used as indicators of NSCLC sta
8、ging and transfer. And the two may occur in the development of NSCLC has a synergistic effect.Key words thrombin-antithrombin complex (TAT); osteopontin (OPN); plasma; non-small cell lung cancer (NSCLC); enzyme-linked immunosorbent assay (ELASA)V宁夏医科大学硕士研究生学位论文 英文缩略词表英文缩略词表英文缩写 英文全称 中文全称TAT thrombin
9、-antithrombin complex 凝血酶抗凝血酶复合物OPN osteopontin 骨桥蛋白 NSCLC Non-small Cell Lung Cancer 非小细胞肺癌ELASA enzyme一linkedimmunosorbentassay 酶联免疫吸附测定4宁夏医科大学硕士研究生学位论文 前言前 言近半个世纪以来，肺癌在恶性肿瘤中已居首位，统计显示，目前肺癌的发病率和死亡率在全球范围内均居首位，每年世界范围内诊断的新病例超过了50万例,其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌的80%85%。患者5年生存率低于15%，早期发现难、恶性程度高、病程进展快。卫生部2008年4月
10、29日公布的第三次全国居民死亡原因调查结果显示，过去30年间，肺癌死亡率在中国上升了465%，肺癌已取代肝癌成为中国首位恶性肿瘤死亡原因。加强肺癌的基础和临床研究，将有助于肺癌的预防和治疗，对降低其发病率和死亡率，提高人们的生活质量有重要的意义。影响肺癌预后的因素多达百余种，在众多因素中有主要因素和次要因素，而肺癌的TNM分期其中一主要因素，近年来，对影响肺癌预后的单因素和多因素分析提示肺癌的TNM分期是影响预后的主要独立因素。大部分肺癌患者死亡的原因并不是原发灶本身，而是肿瘤的浸润、转移和复发所致，原发灶转移一直是影响肿瘤临床疗效的主要因素。近年来的分子生物学研究表明，肿瘤的侵袭、转移和复发
11、也是一个多基因参与、多阶段演进的极其复杂的生物学过程。这个过程包括癌组织在浸润转移前进行细胞自身的黏附解除，癌细胞黏附于基质，癌细胞释放蛋白水解酶降解基质，癌细胞移行，癌细胞浸入血管和淋巴管发生远处转移的步骤。近年来，恶性肿瘤与止血凝血功能和纤溶活性的相互关系日益受到重视。肿瘤细胞可直接或间接地影响血液凝固，导致血液凝固性增高或出血倾向，而止血凝血功能和纤溶活性的改变也可影响肿瘤细胞的表型和活性，从而使肿瘤细胞在局部增殖、浸润甚至向其他部位转移1。凝血酶(thrombin)最为人们熟知的是它是一种重要的凝血因子，在血栓形成、血管损伤、炎症、组织损伤修复方面起重要作用;它还能够引起血小板聚集、内
12、皮细胞分泌细胞因子、纤维母细胞和平滑肌细胞增殖等细胞反应。此外，凝血酶还能够激活正常及恶性细胞的致瘤潜能，并能导致转移表型的出现2。生理或病理情况下，凝血酶原裂解生成凝血酶，很快被抗凝血酶所中和，故很难直接检测凝血酶的含量，而凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）可作为凝血酶早期形成的分子标志物之一。骨桥蛋白(osteopotin,OPN)，是一种分泌型磷酸化糖蛋白，它是细胞外基质(extracllullar matrix,ECM)中的一种非胶原蛋白，能促进细胞的粘附、趋化和迁移，因而在骨组织矿化、细胞粘附、信号转导、细胞免疫、血管再塑等方面具有多种生物功能。近年来的研究表明，多种类型的肿瘤细胞在体内
13、、外均产生OPN参与肿瘤发展的多个环节,在不同的恶性肿瘤转移形成过程中发挥重要作用3。OPN的受体家族包括整合素受体和CD44受体。整合素受体包括av3、av5、a91、a41等。正常情况下，OPN主要与CD44受体结合，通过与一些整合素受体和CD44受体结合，从而促进细胞的趋化、黏附和迁移，参与骨的吸收和形成4。近年研究发现，OPN在许多肿瘤组织中高表达，如肝癌、肺癌、乳腺癌及头颈部肿瘤中等，其在原发肿瘤及其转移瘤组织中的均有表达上调，提示OPN在肿瘤的发生发展、侵袭转移、肿瘤血管生成及抑制凋亡中具有一定作用5。研究发现 ，凝血酶与OPN的化学结构存在一定关系，不同OPN结构如全长OPN、被
14、凝血酶裂解后的OPN、磷酸化或非磷酸化形式等使OPN功能不同。经凝血酶裂解OPN N端片段与整合素结合能力比完整OPN强。我们以此为依据，通过ELASA法观察二者在非小细胞肺癌发生发展中的作用。宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料与方法材料与方法1 材料1.1资料来源1.1.1实验对象NSCLC组: 收集2008年11月-2009年9月宁医附属医院胸外科及呼吸科经病理确诊的非小细胞肺癌患者共46例，鳞癌21例，腺癌25例，年龄20-76岁，男28例，女18例。正常对照组: 来自宁医附属医院体检中心的健康查体者，共收集20例，其中男性5例，女性15例，平均年龄48士6(22一67)岁，且与NSC
15、LC组在年龄及性别上差异无统计学意义。良性肺部病变组22例良性肺部病变患者（4例结核球、4例支扩、4例错构瘤、3例肺囊肿、3例炎性假瘤、2例硬化性血管瘤、1例良性乳头瘤、1例平滑肌瘤），与NSCLC组在年龄及性别上差异无统计学意义。1.1.2 肺癌分期标准：1997年国际抗癌联盟TNM分期1.1.3病例纳入标准(1)临床病理诊断明确的非小细胞癌患者(2)良性病变组为外科手术病理学检查证实的患者(3)年龄在20-80岁之间1.1.4病例排除标准(1)有严重的心、肝、肾功能障碍或其他重要脏器功能衰竭者(2)血液系统疾病及血栓栓塞性疾病患者(3)肾结石患者(4)风湿性疾病及免疫性疾病(5)孕妇(6)
16、已接受手术及放化疗和输血的患者(7)不符合纳入标准，资料不全的患者1.2实验仪器SYNYO低温冰箱：日本SYNYO公司；L05-2A型离心机：北京产；WS2-261-73电热恒温隔水式培养箱：上海产；EL-800酶标仪：PE公司；打印机：惠普公司；高精度加样器及吸头（1000，100，50）：若干；37恒温箱; 可调多道移液器(50一200pL);供可调多道移液器使用的试剂存放槽1.3实验试剂OPN ELASA试剂盒购于日本IBL公司，TAT ELASA试剂盒购于美国Assayproy公司。2实验方法2.1技术路线技术路线非小细胞肺癌组(46例)肺部良性病变组（22例）健康对照组(20例)抽取
17、空腹静脉血ELASA法检测OPN,TAT探讨与非小细胞肺癌侵袭、转移及分期等病理特征的关系探讨在非小细胞肺癌的诊断、治疗及预后等的临床意义2.2标本采集所有标本均于清晨空取空腹静脉血,与3.8%枸椽酸钠按91比例混匀,1000 r/min离心15分钟, 吸出上层血浆，置于密封管中，取血浆-80度冰箱保存待测。所有标本避免反复冻融。2.3 OPN、TAT检测采用酶联免疫吸附试验双抗体夹心ELASA进行检测，严格按照试剂盒说明进行操作。 2.3.1实验前准备：(1)取出血浆本及试剂盒，平衡至室温。(2)将浓缩洗涤液与医用蒸馏水按要求倍数稀释为应用洗涤液。(3)浓缩样品稀释液用样品稀释液按照要求倍数
18、稀释稀释成应用样品稀释液。2.3.2 OPN检测：(1)取出酶标板，设空白孔，依照次序对应分别加入100ulOPN的标准品于空白微孔中(空白孔视为0号标准品，用稀释液替代)，并标记样品编号，加入100 ul的稀释样品（1：6稀释）于空白微孔中;(2)置于37温育60分钟;(3)将酶标板板取出，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤，并甩去水滴，在吸水纸上将酶标板拍干，重复上述步骤7次;(4)在标准品孔和样品孔中加入100 ul的示踪抗体，4孵育30分钟;(5)将酶标板取出，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤，并甩去水滴，在吸水纸上将酶标板拍干，重复上述步骤9次;(6)每孔中加入100ul显色剂，轻轻振荡混匀;(7
19、)置于室温避光温育反应30分钟;(8)每个微孔中加入100ul的终止液，轻轻振荡混匀;(9)在酶标仪上，450nm处测定OD;显色后，15分钟内进行测定;(10) 计算机通过标准样品的浓度及光密度值绘制标准曲线，并通过样本的OD450值自动读出其浓度。2.3.3 TAT检测：(1)取出酶标板，设空白孔，依照次序对应分别加入50ul TAT的标准品于空白微孔中(空白孔视为0号标准品，用稀释液替代)，并标记样品编号，加入50 ul的稀释样品（1：2稀释）于空白微孔中;(2)置于37温育120分钟;(3)将酶标板板取出，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤，并甩去水滴，在吸水纸上将酶标板拍干，重复上述步骤5次
20、;(4)在标准品孔和样品孔中加入50 ul的生物素化抗体，37孵育60分钟;(5)将酶标板取出，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤，并甩去水滴，在吸水纸上将酶标板拍干，重复上述步骤5次;(6) 在标准品孔和样品孔中加入50 ul的SP结合物，37孵育30分钟(7)重复洗板5次；(8)每孔中加入50ul显色剂，轻轻振荡混匀;(9)置于室温避光温育反应15分钟出现蓝色;(10)每个微孔中加入50ul的终止液，轻轻振荡混匀;(11)在酶标仪上，450nm处测定OD;显色后，15分钟内进行测定;(12) 计算机通过标准样品的浓度及光密度值绘制标准曲线，并通过样本的OD450值自动读出其浓度。3 统计学处理采用
21、SPSS11.5统计分析软件包进行数据分析,采用方差分析比较肺癌不同分期、对照组之间、有无远处转移各组数据之间关系；采用t检验比较良恶性组数据之间关系。两变量间相关分析血浆OPN和TAT的相关性。选定p0.05，见表2.1表1肺癌组、肺部良性病变组及健康对照组外周血中OPN和TAT含量比较分组OPN(ng/ml)TAT(ng/ml)肺癌组（n=46）52.7315.7818.936.20肺部良性病变组（n=22）33.1510.053.801.41健康对照组（n=20）30.649.133.031.08肺癌组与肺部良性病变比较p=0.000(p0.05)肺癌组与健康对照组比较p=0.004(p
22、0.05表2 肺部良性病变组及健康对照组外周血中OPN和TAT含量比较(s )分组TAT（ng/ml）OPN（ng/ml）健康体检组（n=20）肺部良性病变组(n=22)3.03士1.083.80士1.4130.64士9.1333.15士10.05 OPN在肺部良性病变组与健康对照组之间比较P0.05；TAT在肺部良性病变组与健康对照组之间比较P0.05。2 外周血中OPN和TAT与肺癌临床特征的关系NSCLC患者外周血中OPN和TAT的含量随肺癌的临床分期（TNM分期）升高而增加；有远处转移者血浆水平高于无远处转移着。见图3-6、表3-5。图3 NSCLC组TAT血浆水平在TNM分期比较图图
23、4 NSCLC组OPN血浆水平在TNM分期比较图图5 NSCLC组OPN血浆水平在有无远处转移比较图图6NSCLC组TAT血浆水平在有无远处转移比较图表3OPN、TAT血浆水平在肺癌分期及有无远处转移组间比较 (s )临床特征例数TAT（ng/ml）OPN（ng/ml）临床分期I期714.13士3.9342.35士10.41II期1013.63士4.2039.67士11.50III期1420.96士5.6253.35士15.54IV期1522.82士4.9265.70士9.41远处转移有1522.82士4.9265.70士9.41无3117.35士6.0146.17士16.14 注：OPN血浆
24、水平在NSCLCI期与II期间无显著差异P=0.657；I/II期水平较III期低P=0.001；III期与IV期间有显著差异，III期较IV期水平低，P=0.009。各期之间方差分析F值为11.235。有远处转移者水平高于无转移者P=0.000，F值21.336。TAT血浆水平在NSCLC I期与II期间无显著差异P=0.838，III期与IV期间无显著差异P=0.310，I/II期水平较III/IV期水平低P=0.004；各期之间方差分析F值为10.169.有远处转移者水平高于无转移者P=0.004，F值为9.216表4肺癌组OPN及TAT血浆水平在性别间比较(s )性别OPN(ng/ml
25、)TAT(ng/ml)男（n=28）50.08士14.9818.95士6.25女(n=18)56.85士16.5418.91士5.84 OPN血浆水平在性别之间比较P0.05；TAT血浆水平在性别之间比较P0.05表5肺癌组OPN及TAT血浆水平在性别间比较(s )年龄段OPN(ng/ml)TAT(ng/ml)60岁55.27士18.1418.73士6.3060岁49.11士11.1419.22士6.20OPN血浆水平在年龄之间比较P0.05；TAT血浆水平在年龄之间比较P0.05表6肺癌组不同病理类型OPN及TAT血浆水平比较(s )肺癌类型OPN(ng/ml)TAT(ng/ml)鳞癌（n=
26、21）48.89士17.5356.67士12.56腺癌 (n=25)19.46士5.6718.44士6.82OPN血浆水平在不同病理类型之间比较P0.05；TAT血浆水平不同病理类型在之间比较P0.053 NSCLC组中外周血中OPN和TAT的关系肺癌组外周血中OPN和TAT含量间存在明显的相关性，提示两者有协同作用，经两因素pearson相关分析OPN与 TAT的相关，r=0.502, 绘制散点图我们可以看出散点呈椭圆形分布，X、Y呈正向变化，为正相关。见图7， 图7 NSCLC组血浆 OPN与 TAT水平的相关图11讨论早在1865年,Trousseau就观察到恶性肿瘤患者有较高的静脉血栓
27、发生率,1878年，BIUroth报道癌症病人的血栓藏有癌细胞，从而推论血栓的形成可能与癌细胞转移有关。生理或病理情况下，凝血酶原裂解生成凝血酶，很快被抗凝血酶所中和，故很难直接检测凝血酶的含量，而凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）可作为凝血酶早期形成的分子标志物之一。TAT是凝血酶与抗凝血酶(AT-)以11比例结合生成的酰基共价键复合物,相对分子质量约10万,其内部酰化键较牢固,在PH中性时,加蛋白变性剂并加热到100不解离,它是凝血酶早期形成的分子标志物之一。在血液凝固与抗凝过程中，凝血酶与抗凝血酶I(ATl)以一定摩尔浓度结合，生成酸基共价键结合的凝血酶一抗凝血酶I复合物(Thrombin一
28、antithrombin，TAT复合物)，该复合物的生成量与生成率可能是体内抗凝、凝血物质活化的标志.目前常以ELISA法检测血浆TAT复合物含量，其敏感性及特异性均较好。该项指标有益于检测血栓形成，对抗凝及溶栓疗效观察具有重要作用，对DlC的诊断较准确，且恶性肿瘤等患者血浆TAT复合物含女均显著增高. Kwon HC6,等通过对110名胃癌患者进行血清检测D-2聚体、TAT、凝血酶原片段F1+2水平得出凝血酶片段量与胃癌分期及淋巴转移呈正相关。den Ouden（7等对50例良性卵巢癌、39例恶性卵巢癌及39例健康对照女性进行血浆TAT,D-2聚体检测发现二者在恶性卵巢癌患者血浆水平明显升高
29、具有统计意义，在鉴别良恶性诊断价值等同于CA 125，提示凝血和纤溶作用在卵巢癌中作用显著。Tricerri8等对73名肺癌患者进行血浆TAT水平进行纵向研究发现，TAT可以作为肺癌患者凝血异常的主要指标，与肺癌分期呈正相关，早期检测凝血异常和适当治疗可预防血栓栓塞。OPN的结构和功能以及凝血酶和OPN的结构关系：1979年Senger等首次报道一种与恶性转化有关的一种包含RGD(精-甘-门冬氨酸)整合素结合区的磷酸化糖蛋白与肿瘤的关系,称之为转化相关性磷酸蛋白。后来Franzen等从骨组织中分离出一种磷酸蛋白,其特性与Senger等发现的磷酸蛋白相似,因其是细胞在骨基质中的产物，并能在细胞与
30、基质中的矿质形成一种桥连，人们将其命名为骨桥蛋白。OPN是带负电的酸性亲水性分泌型糖蛋白，由314个氨基酸残基组成(其中天冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸残基占的比例超过50%)，分子量为41.5kDa，其N-端有16水氨基酸残基组成的信号态序列，缺少锚定区，二级结构含有8个螺旋和6疏个片层。氨基酸序列分析表明，OPN蛋白分子中含有特异的RGD(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列9 ，该序列是骨桥蛋白分子发挥粘附功能的结构基础。RGD序列具有高度保守性，如果变异或缺失，将丧失其粘附功能。研究显示，在肿瘤组织中OPN激活信号转导通路通过两类受体：av整合素受体家族和CD44受体家族。研
31、究显示av整合素参与调节肿瘤细胞迁移、内皮细胞存活和迁移以及新生血管管腔形成10。而CD44参与宿主免疫细胞对肿瘤的识别，并与组织恶变、肿瘤生长、肿瘤细胞黏附及浸润转移有关11-12。OPN因此可促进细胞的趋化、黏附和迁移，在肿瘤的发生发展，特别是转移的过程中发挥重要作用。RGD结构域下游6个氨基酸处有凝血酶裂解位点，OPN被凝血酶裂解成两个大小相近的片断，以暴露整合素和CD44等结合位点，OPN被凝血酶裂解成两个功能区N端片断经磷酸化后可以和整合素受体结合，尤其是对整合素 av3和 av5特异性强;C端片段含有薪附分子CD科包括变异体结合位点。整合素l可能作为OPN的受体，同整合素a链结合可
32、诱导细胞迁移，它还可以和CD44协同作为细胞膜表面的OPN受体。其介导OPN与细胞的结合 。转移是恶性肿瘤的重要生物特性之一，大量研究表明，OPN与多种肿瘤细胞的发生、发展、浸润、转移有关。Coppla 13 等采用免疫组织化学技术检测350例病人肿瘤组织及113例不同部位的正常组织的OPN蛋白表达。结果显示，不同组织的肿瘤细胞都有不同程度的OPN强染色现象。有日本学者建立了OPN缺陷的小鼠模型，将B16（一种不表达OPN的黑色素瘤细胞）注入小鼠左心室内，实验结果表明，相比较正常小鼠，这种OPN缺陷的小鼠骨肿瘤，肾上腺肿瘤数目明显减少，改为骨静脉注射后，发现肺转移结节数目也明显减少14。Reinholz MM15,等使用rt-PCR和实时定量PCR法检测5例原位导管癌、24例初期乳腺癌、5例远处转移(肝和骨转移)与18例正常乳腺组织OPNmRNA,得出结论，OPN基因表达在乳腺癌的侵袭及转移有显著意义。Zhang Jin16等报道，OPN在非小细胞肺癌组织和肺癌细胞系中均过度表达而，在小细胞肺癌极少表达，尤其是鳞癌中，且OPN表达受Ras基因调控，特别在晚期转移肿瘤患者的恶性肿瘤细胞中过度表达，表明可能与肿瘤细胞迁移和转移有关。Rudland 等17对 333 名、 期乳腺癌患者进行了长达19年的随访后发现： 癌组织 OPN 表达
