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1、液相色谱的方法开发,分离机理及色谱柱,选HPLC参数时的基本考虑,溶解度-选择流动相的条件分子量-在样品预处理或GPC分析时有用官能团-有否离子化基团?保留特性如何?样品的基质-考虑如何前处理在基质中样品的含量-分析、制备都考虑检测特性-有否紫外吸收?荧光?找出样品中不同组份之间的差异摸索条件的重要线索,极性问题,液相色谱的分离机理,正相 反相 体积排除 离子交换 其他不同的分离模式是不同的机理,吸附色谱的分离机理,随着样品在固定相上的吸附能力由大到小在色谱柱上的保留由长到短,吸附色谱概述,分离基于样品的极性差异。洗脱次序一般为正相，即：极性低的先被洗脱常用的流动相非极性有机溶剂，如己烷乙酸等
2、为添加剂常用固定相硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。,分配色谱的分离机理,分配色谱概述,反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱常用的流动相：有机溶剂如甲醇、乙腈，水应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基团反相色谱固定相多为键合相?,键合相色谱柱,以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。优点固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点pH值不能小于3同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同,体积排除色谱的分离机理,凝胶色谱概述,凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC）分离基于分
3、子在溶液中的体积大小 洗脱次序：大分子先被洗脱 流动相不参与分离，只起溶剂作用 分离效率低 色谱行为容易预测,GPC的校正,分子量大于V0或小于Vt的分子不能分离,离子交换树脂的分离机理,离子交换色谱概述,适用于离子型化合物的分离分离基于离子的带电特性洗脱次序受多种因素的影响填料（离子交换树脂）的种类阴/阳，强/弱，交换基团样品分子特性盐的种类、浓度温度及pH值有机溶剂,离子交换树脂的交换容量,液相色谱柱及分离机理的关系,从色谱方法上分正相/反相离子交换分子体积排除亲合疏水回受,从柱子类型上分分配/吸附离子交换凝胶亲合,色谱柱化学及外形结构的关系,对HPLC柱的了解,平均颗粒度，颗粒度分布颗粒
4、度(dp)颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)颗粒分布颗粒分布越宽柱效低(渗透性差)颗粒形状球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展,对HPLC柱的了解（二）,平均孔径/孔体积孔径/孔体积分布大的孔径可分析高分子量的分子,对HPLC柱的了解（三）,键合相化学影响化合物的分离度：a 不同键合相对不同种类的化合物分离不同可能导致色谱的分离机理不同如：C18、C8、CN,对HPLC柱的了解（四）,含碳量含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加）高含碳量有利于不易保留的化合物的分离水解稳定性好，重现性好有利于极性化合物的拖尾改善
5、低含碳量有利于分析中性及碱性化合物降低溶剂损耗,不同色谱柱的含碳量,色谱柱C%k苊(50/50的乙腈/水)Symmetry C181917Zorbax ODS1715.7LiChrosorb RP-181510.3Symmetry C81212.5Resolve C-181212.4Ultrasphere ODS1111.3Partisil ODS-31112.0mBondpak C-1810 7.9Nova-Pak C-18 7 5.5,对HPLC柱的了解(五),填料的端基封口封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）,残基处理的效果,NovaPak C18,未封口 C1
6、8,抗坏血酸 烟酰胺 对氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黄素 苯酚 盐酸硫胺,对HPLC柱的了解（六）,硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为：k生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同是选择性差异的主要来源硅胶的杂质含量重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小是色谱柱质量好坏的重要标志,对HPLC柱的了解（七）,填料的稳定性硅胶填料pH：2-8聚合物填料pH：2-12pH值小于2时键合相水解,Waters各种硅胶基质的色谱柱,Waters不同品牌的色谱柱,mBondaPak文献背景强,是工业标准平均孔径125A，10m高活性、无定形硅胶中等疏水性表面，端基封口。有独特选择性Nova-Pak平均孔径60A，
7、4m高韧度低活性球形硅胶低酸性，高疏水性，好的端基封口有利于小分子物质的分析,Waters不同品牌的色谱柱,Resolve平均孔径90A，5/10m低活性硅胶非常高的疏水性，无端基封口有利于低保留的中性及酸性化合物分离Delta-Pak有100A和300A两种孔径，5/15m硅胶中到高的疏水性，端基封口适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱,新一代硅胶基质的色谱柱,Symmetry高纯度硅胶：Fe，Al，Mg等均10ppm 孔径100A，5m球形颗粒，端基封口超高含碳量：C18/19%，C8/12%表面积：300 m2/g孔体积：1mL/g特点好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长,Waters聚合物基质的反相柱,特殊设计的多孔聚合物胶有很宽的 pH 适应范围（2-12）可用离子抑制方法分析碱性化合物有非常不同的选择性柱效及韧性比相应的硅胶柱低色谱机理不太清楚文献背景低，用户少,色谱柱的规格,内径检测的灵敏度样品的容量长度分离度，理论塔板数速度样品的容量检测的灵敏度,
