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1、凋亡检测,DNA LADDER,主 要 内 容,凋亡概述凋亡检测方法的历史沿革DNA Ladder 实验 实验原理 实验材料及试剂 实验步骤及结果,Apoptosis,Necrosis Apoptosis(Kerr and Wyllie,1972),Apoptosis,A genetically programmed,non-necrotic cell death.Involved in tissue homeostasis,cell differentiation.Play major role in a variety of diseases(e.g.Alzheimer,AIDS,hear
2、t failure and cancer).,凋亡与坏死的差别,凋亡 坏死,胞体 变小 变大,胞膜 皱缩,形成空泡 肿胀,通透性改变,结局 形成凋亡小体被邻近细胞吞噬细胞 崩解,引起炎症反应,Apoptotic Assay,Morphology,DNA Fragmentation,DNA Ladder,Caspase Activity,Anti-PARP western blot,Cell Membrane Alteration,Phosphotidylserine Exposure,Apoptotic Assay,MorphologyDNA Fragmentation DNA Ladder
3、Caspase Activity Anti-PARP Western blotCell Membrane Alteration Phosphotidylserine Exposure,endonuclease,Gel electrophoresis,Distance between cuts=mutiple of 180 bps,180 bps,Apoptotic DNA Ladder,Lane 1:MarkerLane 2:negative controlLane 3:DNA of apoptotic cellsLane 4:DNA of necrosis cells,金标准,实验原理,细胞
4、凋亡过程中,可发生特异性级联生化反应,其中最具特色的是内源性核酸内切酶的激活.此酶可作用于连接DNA的核小体间区域,DNA链被切割成180200bp或其整倍数的片断.抽提DNA,经琼脂糖电泳可见梯状电泳图谱,固定：将细胞生前结构和化学物质双重地保存下来，需要先固定。方法：1）物理固定，空气干燥，冻结干燥。2）化学固定，如甲醇，乙醇，丙酮，甲醛等。,实验步骤,获取凋亡细胞,抽提DNA,琼脂糖凝胶电泳,实验步骤,取16g大小的小白鼠,外科手术取胸腺,少许洗去血迹,放入研磨器中(160目)研磨,边磨边加1640液,获取单个胸腺细胞.将所得混悬液倒入三角烧杯,加入120ml 1640液(一般一只小白鼠
5、可获2x106/ml 细胞),每孔加入1.2ml DEX(5mg/ml)混匀,co2培养箱,370c,5h,取1ml混悬液,加入24孔培养板中,将每孔细胞悬液转移至新的Ep管中,3000rpm,5min,去上清,加入70%乙醇700ml混匀.震荡打散细胞,-200c固定过夜,离心，3000rpm，5min,去上清（不要回倒，棉棒沾干液体，勿触及沉淀）,将上清转入1.5ml EP管，离心12000rpm 3min,加400ul裂解液，加100ul蛋白酶k,混匀，600c水浴，30-45min,100ul饱和Nacl,充分震荡，离心12000rpm 3min,将上清转入无水乙醇管，颠倒离心管数次可
6、见白色絮状物（DNA）,离心12,000 rpm，1min，弃上清，并用棉签吸干残留的无水乙醇,析出的DNA应成小白点状沉淀于管底，如贴附于管壁，加溶解液时应小心。,取凝胶到凝胶成像仪上拍照分析,加入20ul溶解液至管中，反复吸打数次至DNA溶解,电泳80v,1h,吸出20ul已溶解的凋亡细胞DNA，加入到2%琼脂糖凝胶孔电泳,1.取出胸腺后,一定要注意将组织去除干净。2.样本须先经70%乙醇固定,以防止DNA降解。3.70%乙醇,无水乙醇应-200c预冷。4氯仿抽提蛋白时，应用振荡器剧烈振荡，吸移上清时，注意不要将蛋白质层吸动时（宁少勿多，以免蛋白质污染）5可根据DNA量的多少加样。6.用2%agrose电泳可获较佳分离效果。,注意事项,实验结果,
