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1、化妆品中铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的检测,目的：1.了解化妆品中铜绿假单胞菌检测的基本过程。2.掌握几种培养基的配置方法。3.掌握铜绿假单胞菌的鉴定及生化特征。原理：铜绿假单胞菌为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，在普通培养基上生长良好，菌落大小不一，平均直径2mm3mm，扁平，边缘不整齐，且常呈相互融合状态。氧化酶阳性，能产生绿脓菌素，此外还能液化明胶，还原硝酸盐产生氮气，在42条件下可以生长，可与类似菌区别。,操作步骤,检样前化妆品的处理 接样于营养肉汤增菌，37，12h，140rpm培养分离培养，挑取培养物接于十六烷基三甲基溴化铵平 板，37，18-
2、24h 染色镜检,配十六烷基三甲基溴化铵培养基（选择性培养基，大肠杆菌不能生长，革兰氏阳性菌生长完全受到抑制）配绿脓菌素测定用培养基，明胶培养基，硝酸盐蛋白胨水培养基，普通琼脂斜面培养基,操作步骤,特征性检验氧化酶 绿脓菌素 硝酸盐还原 明胶液化 42 生长 试验 试验 产气试验 试验 试验取菌+1滴 接菌，37 接菌 接菌 接菌二甲基对 24h+氯仿 37 24h 37 24h 42 24h 苯二胺 移出+盐酸紫红色（+）紫红色（+）有气体（+）溶解成液状（+）生长（+）不变色（-）不变色（-）无气体（-）未溶解（-）不生长（-）,实验一 培养基的制备及细菌的分离培养,实验目的,掌握培养基制
3、备的原理和方法掌握细菌的分离培养了解灭菌方法,实验原理,不同的微生物生长繁殖都需要提供一定的营养条件，在实验室中，微生物的营养是由培养基来提供的。培养基是按照微生物生长繁殖所需要的营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。除营养条件以外，微生物必须在最适酸碱度范围内才表现出最大生命力，因此，应针对不同的微生物将培养基的pH值调节到适当范围。,操作步骤,按培养基配方称量,加水加热熔化,调节pH值,分装包装,灭菌备用,操作步骤,1.绿脓菌素测定用培养基300ml 加热溶解 调pH 分装试管 高压 制成斜面2.明胶培养基300ml 加热溶解 调pH 分装试管 高压 直立制成高层3.硝酸盐蛋白胨水培养基
4、300ml 加热溶解 调pH 分装有小倒管的试管 高压 直立制成高层4.普通琼脂斜面培养基300ml 加热溶解 调pH 分装试管 高压 制成斜面,注意事项,培养基溶解时，加有琼脂的培养基易沸，应注意看守。注意调节培养基的pH。称牛肉膏用玻片，称甘油用小烧杯。加热后应补足液量。注意做好标记。,细菌的分离培养,原理：通过划线，将混杂的细菌在平板表面逐一分散，经培养后，各自形成菌落(colony)。根据菌落形态、特征挑选单个菌落，移种培养后，即得到纯种细菌。,方法：平板划线法有几种，可根据不同情况选用其中一种。(1)平行划线法 此法适用于含菌不多的液体标本，如脑脊液(CSF)、腹水、分泌物、脓汁以及
5、稀薄的菌液等。左手斜持平板底，右手持接种环。接种环在火焰上灭菌，冷却后，沾取一接种环标本，先在平板的一端涂开，并从此处开始向下划密集的平行线，约占平板面积的一半。将平板转180角，从平板另一端开始也划密集的平行线，直到划满平板的剩余部分。将平板底放入盖内，接种环火焰灭菌后放下，将平板倒置，37培养。,(2)分区划线法。此法适用于含菌多的检测标本，如粪便，喀痰、细菌固体培养物等。划线前的操作同平行划线法。先在平板的一端将标本涂开并在平板的1/51/4面积上划密集的平行线，接种环火焰灭菌。将平板转约70角，待接种环冷却后，使接种环通过已划线的1区57次，以后即不与1区接触作连续密集划线，约占平板面
6、积的1/4，接种环再通过火焰灭菌。再转平板约70，如上法在第3区划线，此后接种环不再灭菌。重复上述操作在第4区划线，划满余下的培养基表面。将平板底放入盖内，接种环灭菌后放下，置37培养。,实验二 染色镜检及五项指标试验,革兰氏染色方法,涂片干燥固定染色镜检1涂片：取一洁净的载玻片，用记号笔在载玻片做好标记，并在载玻片中间滴一小滴生理.盐水，以无菌接种环挑取少量菌体涂片，玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。2干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将
7、涂膜烤焦。3固定：用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。,4染色：初染:将结晶紫染液加于涂膜上，1min。媒染:水洗后加芦戈氏碘液处理，1min。脱色：水洗后用95乙醇脱色，并摇动玻片，直至流下的液体无色为止，约需0.5min。复染：水洗后加石炭酸复红稀释液染色，1min。水洗，用滤纸吸干，待标本充分干燥后进行镜检。5镜检：干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈
8、假阳性。,注意事项：,酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在1824h之内。,革兰氏染色方法操作步骤,涂片,生理盐水,接种环,草酸铵结晶紫,碘 液,95%乙醇,自然干燥,媒染1min,脱色0.5min,固定,初染1min,复染1min,干燥镜检,复红,铜绿假单胞菌
9、镜下形态图示：,氧化酶试验,原理：有氧呼吸过程中，氧化酵素（oxidase）于电子传送系统扮演一重要角色，其可藉氧分子将已还原之细胞色素（reducedcytochrome）氧化，产生水或过氧化氢。好氧菌与部份兼性厌氧菌及微好氧菌均具氧化酵素之作用，本实验有助于区分奈瑟氏菌属（Neisseria）、假单胞杆菌属（Pseudomonas）此二属为氧化酵素阳性(oxidasepositive)，与肠道杆菌科（Enterobacteriaceae）此科之细菌为氧化酵素阴性（oxidasenegative）。方法：白色滤纸片 取菌+1滴1%二甲基对苯二胺 1530s 变红色（+）不变色（-）,实验三
10、结果观察及报告,绿脓菌素实验：23个可疑菌落绿脓菌素培养基37 24h 35mL氯仿振荡 提取液呈蓝色取液体于一新试管+1mL1mol/L盐酸 上层盐酸内变为红色为阳性，不变色则为阴性。硝酸盐还原产气实验：可疑菌落硝酸盐蛋白胨水 37 24h 小倒管内有气体产生为阳性，否则阴性。,明胶液化实验：可疑菌落穿刺接种于明胶培养基 37 24h 取出放冰箱1030min 呈溶解状为阳性，不溶解则为阴性。42生长实验：可疑菌落普通琼脂斜面42 24h铜绿假单胞菌生长，而近似的荧光假单胞菌不能生长。,结果判断,氧化酶（+）绿脓菌素（+）可报告检出 典型或可疑菌落 氧化酶（+）绿脓菌素（-）明胶液化（+）可
11、报告检出 硝酸产气（+）42 生长（+）,革兰氏染色（Gram staining）:革兰氏染色法是由丹麦医生Gram于1884年创立，其简要操作分初染媒染脱色复染。如果染色得当，镜检发现G+菌体呈蓝紫色，G-菌体呈浅红色。通过革兰氏染色法可把所有细菌分两在类。因此它是分类鉴定菌种的重要指标。其染色机制：通过初染和媒染操作后，在细菌细胞的膜或原生质体上染上了不溶于水的结 晶紫与碘的大分子复合物。革兰氏染色阳性（Gram Positive）:革兰氏阳性菌由于细胞壁厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧 密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，再加上它基本不含类脂，故用乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此结晶紫与 碘复合物仍牢牢阻留下其细胞壁内，使其呈现蓝紫色。革兰氏染色阴性（Gram Negative）:革兰氏阴性细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，这样，结晶紫与碘的复合物就极易被溶出细胞壁，因此通过乙醇脱色后，细胞又呈无色。这时，再经番红等红色染料进行复染，就使革兰氏阴性获得了浅红色。,
