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1、实 验,斯达油脂酵母胞外多糖发酵,主讲：徐尔尼 生命科学学院生物技术系,一、目的要求,学习微生物发酵法生产菌体胞外多糖。学习微生物胞外多糖含量的检测方法。,二、基本原理,微生物胞外多糖是指分布于细胞壁之外，以荚膜的形式附在细胞壁上或以粘液的形式分泌于胞外环境同型多糖或异多糖。许多微生物均能产生胞外多糖，但只有在合适的培养条件下才能大量产生，积累该产物。本实验以斯达油脂酵母为生产菌种，选用高碳氮比的液体发酵培养基及高通气量等有利于菌株多糖合成的培养条件进行胞外多糖发酵。,本实验多糖的定量测定采用苯酚硫酸法,多糖在浓硫酸作用下生成糖醛，糖醛能与酚类化合物作用生成有色物质，在490nm处有最大吸收值
2、，且颜色深浅在一定范围内与糖含量呈线性关系，因此可采用分光光度法进行定量测定。,三、实验器材,一）菌种 斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi)2.1390 二）试剂甘露糖标准液（100ug/mL）：准确称取干燥至恒重的甘露糖10.0mg，用蒸馏水溶解并定容至100mL。6%苯酚溶液（临用前用重蒸酚配制）浓硫酸95%乙醇饱和氯化钾溶液75%乙醇,二）试剂 费林试剂A（硫酸铜溶液）：将34.5g结晶硫酸铜溶于500mL蒸馏水中，加0.5mL浓硫酸，混合均匀。费林试剂B（酒石酸钾钠碱性溶液）：将125g氢氧化钠和137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，贮于带橡皮塞的瓶内。三）培养基
3、斜面培养基：蔗糖2%，酵母膏0.5%，琼脂1.8%，pH6.5。种子培养基：蔗糖2%，酵母膏0.5%，pH6.5。发酵培养基：蔗糖8%，蛋白胨0.3%，K2HPO43H2O 0.35%，KH2PO4 0.35%，无机盐溶液0.5%（V/V），pH6.5。无机盐溶液：MgSO47H2O 0.4%，MnSO4H2O 0.2%，FeSO47H2O 0.2%，NaCl0.2%。,三、实验器材,三、实验器材四）玻璃器皿及其它物品 刻度吸管1ml、2ml、5ml、10ml，150ml三角瓶、250ml三角瓶、250ml量筒、18180试管、pH精密试纸、纱布、牛皮纸、接种环、移液枪、酒精灯五）仪器 高压灭
4、菌锅、振荡培养箱、722型分光光度计、电热恒温水浴锅、离心机,三、实验器材每组实验器材：（4人/组）250ml三角瓶 1个、刻度吸管1ml 3支、2ml 3支、5ml 3支、10m 3支，18180试管 10支、纱布、牛皮纸等。,四、实验步骤配制发酵培养基 灭菌 接种、发酵培养 发酵液的处理 多糖的提取 甘露糖标准曲线的制作 发酵液多糖的测定 发酵液中胞外多糖含量计算,五、实验内容一）配制培养基：（4人/组）发酵培养基蔗糖8%，蛋白胨0.3%，K2HPO43H2O 0.35%，KH2PO4 0.35%，无机盐溶液0.5%（V/V），pH6.5。（配50mL）无机盐溶液：MgSO47H2O 0.
5、4%，MnSO4H2O 0.2%，FeSO47H2O 0.2%，NaCl0.2%。（全班配200mL）培养基配制步骤：称量加水加热溶化调pH分装 配制好的种子和发酵培养基分装在150mL和250mL的三角烧瓶中，装量为30mL，用8层纱布展平包于瓶口，再用牛皮纸包扎，贴上标签，写好组名。,五、实验内容二）培养基和实验器材料的灭菌处理 培养基灭菌 取已分装并包扎好的培养基，置灭菌锅1210C灭菌20min。,五、实验内容高压蒸汽灭菌法操作步骤如下：1.将灭菌器内加入一定量的水，把待灭菌的物品放入其中；2.接通电源加热；3.排除高压锅内的冷空气；可将排气阀打开，待排出大量汽体后关闭排气阀，或关闭排
6、气阀，当压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀；4.当压力达1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为121，维持20min；5.灭菌维持时间到了，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品；,五、实验内容三）发酵培养 1、接种 取移液枪，采用无菌操作吸取斯达油脂酵母种子培养液1.0ml，接入发酵培养基中。2、发酵培养 将已接菌的发酵培养基置振荡培养箱内，280C、120r/min，培养108h，得斯达油脂酵母多糖发酵液。,五、实验内容四）发酵液的处理 将装有发酵液的三角烧瓶从振荡培养箱中取，用吸管吸取发酵液5ml，置离心管内，35
7、00r/min离心15min除菌体。五）胞外多糖的提取 1、多糖的粗提 取离心上清液2ml，置离心管中，加蒸馏水4ml（稀释3倍），调pH6.0。取1ml稀释液，置离心管中，加95%乙醇3mL，氯化钾饱和液1滴，混匀。3500r/min离心10min，弃上清液。沉淀即为多糖粗提物。,2、多糖的洗涤 沉淀加75%乙醇5ml，振荡混匀洗涤，3500r/min离心5min，弃上清液。沉淀再加75%乙醇5ml，振荡混匀洗涤，3500r/min离心5min（洗涤二次）。直至上清液无还原糖反应，如无还原糖反应则将上清液倾去，沉淀即为胞外多糖。将沉淀溶于蒸馏水中并稀释至适当浓度（加8mL蒸馏水振荡充分溶解）
8、为样品液。,五、实验内容六）甘露糖标准曲线的制作 取6支干净试管，分别加入100ug/mL甘露糖标准溶液0、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，不足1ml管加蒸馏水补足至1ml，各管加6%苯酚溶液1.0ml，摇匀，再加入浓硫酸5.0ml，混匀静置10min，然后在25-300C水浴中放置20min，取出。用1cm玻璃吸收池，以空白管溶液为对照组，在波长490nm处依次测定各管溶液的光密度值（OD）。以甘露糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制甘露糖标准曲线。注意要点：试管和吸管要冼干净，取样要准确。,五、实验内容七）样品液多糖的测定 取1支干净试管，加样品液0.2ml，
9、蒸馏水0.8ml，6%苯酚溶液1.0ml，摇匀，再分别加入浓硫酸5.0ml，混匀静置10min，然后在25-300C水浴中放置20min，取出。用1cm玻璃吸收池，以甘露糖空白管溶液为对照组，在波长490nm处测定溶液的光密度值（OD）。根据甘露糖标准曲线，求出样品液中每毫升甘露糖的微克数。注意要点：加入苯酚和浓硫酸处理后，待测试管内溶液颜色的深浅最好在甘露糖标准溶液试管颜色的深浅变化之间。,八）发酵液胞外多糖含量的计算胞外多糖ug/ml=从标准曲线查得的甘露糖微克数 稀释倍数0.9,六、实验数据及处理结果 记录实验操作步骤及实验数据。计算发酵液中胞外多糖的含量。,七、思考与讨论 为什么在高碳氮比的液体培养基中及高通气量进行发酵有利于菌株多糖的合成？,实验报告格式一、实验项目名称二、实验目的三、实验基本原理四、主要仪器设备及耗材五、实验步骤六、实验数据及处理结果七、思考讨论题,五、实验内容无还原糖反应测定步骤如下：1.取二支干净试管，各加入1ml费林试剂A和1ml费林试剂B，混匀。2.其中一支试管加75%乙醇1ml，另一支试管加75%乙醇样品洗涤液1ml。3.二支试管放入沸水浴中加热2-3min，取出冷却，观察是否有红色沉淀生成。还原糖反应测定原理：CHO COONa（CHOH）4+2Cu（OH）2+NaOH 加热（CHOH）4+2Cu2O（红色）CH2OH CH2OH,
