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1、无菌制剂工艺cGMP指南,目录,一、简介和框架二、无菌制剂对环境、设施设备要求三、人员要求四、对组分和密封件要求五、对内毒素控制六、对生产时间限制七、对无菌工艺和灭菌方法验证八、对实验室的控制九、无菌测试要求十、对批记录的审核十一、附录1.无菌工艺的隔离系统附录2.吹灌封三合一技术（略）附件3.灌装和封口操作前的工艺技术十二、相关指南和术语（略）,一、简介和框架,本无菌工艺cGMP指南（200409）替代了1987年的无菌工艺工业指南。本指南主要是针对无菌产品和生物制剂产品的无菌工艺要求的GMP指南。本指南应结合“人用药/兽用药新药申请无菌工艺验证文件递交指南”一起指导工业企业的无菌工艺生产。
2、本指南不具有任何的法律约束力。药政框架本指南从属于药品生产质量管理规范（21CFRparts210和211）；对于生物制剂产品从属于21CFRparts600和680的监管，并对其无菌工艺做了增补的要求。,技术框架本文的无菌工艺和终端产品灭菌工艺有本质上的区别：以终端灭菌工艺的产品在高质量的环境下进行灌封，但此种产品及其生产环境、容器和密封系统并非完全无菌，最终产品需要进行热压或幅射灭菌。无菌工艺的产品、容器/密封件都必须事先分别用无菌方法处理，再于严格控制的环境下操作成最终的产品，其最终产品不能进行灭菌操作。因此无菌工艺含有更多的工艺变量，各组成部分的灭菌方法也不尽相同，过程引入的偏差环节较
3、多，其任何的人为操作都是潜在的污染源。只有不适用终端灭菌处理的产品才考虑用无菌工艺过程。,二、无菌制剂对厂房设施设备要求,对无菌工艺制剂的洁净区必须有监控微粒和微生物的设施；其洁净厂房在使用前必须进行静态测试合格，否则认为验收不合格；其洁净厂房的洁净级别划分必须以动态条件下测试的数据为准；必须用日常的动态数据监控证明其洁净级别始终如一。,1.cGMP对洁净级别的划分,2.关键区域的控制,关键区域定义：无菌药物和容器及密封件所暴露的环境区域，这个区域必须可以维持产品在无菌的状态（如无菌过滤和无菌灌封）。关键区域的操作活动包括：灌装和封口之前及过程中的无菌物料的操作，如无菌连接和无菌组分的添加。无
4、菌区域必须控制0.5um的颗粒，在使用后必须在动态测试下符合100级要求。动态检测时的检测距离为在气流范围内离操作区1英尺（0.3048m）尘埃粒子计数器的放置和采样口的朝向必须合理，以获得有效的样品。（对于HEPA安装在房间顶棚上的洁净区，其尘埃粒子计数器应放在离地0.71m处，采样口朝上。）日常生产每班都应进行无菌区颗粒度的监测（FDA无菌工艺cGMP指南建议使用远程技术来实现）。,可以采用动态条件下操作前的颗粒水平来判定有否外源性颗粒污染。应采用能维持单向流的高效空气清除关键区域的颗粒。应控制区域中的紊流和静置空气的产生，因为它们为空气污染提供了渠道。应有完整的测试记录来分析证明其空气流
5、是否为单向，并且要有书面的结论（涵盖对无菌操作和设备设计的影响评诂）。可以用录像或照像形式证明气体流动的方向。关键区域的空气监测结果是最终没有微生物的污染，如果发生则应高度重视并调查。3.支持区域的控制支持区域的定义：用于制备、贮存或转移非无菌组分、配方产品、中控物质、设备、容器密封件的区域。FDA推荐直接临近无菌工艺生产的支持区域在动态条件下至少应达到万级（ISO7）。工厂可以采用千级（ISO6）或维持整个无菌灌封间在百级（ISO5）。,4.洁净区的隔离预防污染的一个关键环节在于对不同操作区域间的有效隔离，应确保洁净区的空气流以合适方式从高级别区流向相邻的低级别区。在高级别区和低级别区之间应
6、至少保持1015Pa的正压差。进入无菌工艺操作间的更衣室和缓冲间的洁净级别应与无菌操作间的洁净级别一致。无菌操作间与其邻近的无任何洁净级别要求的房间必须始终保持12.5Pa的正压差来防止污染。如果压差低于设定的最低限值，必须对无菌操作间的环境质量进行修复和再确认。对于低压差的发生应有报警装置进行监控，任何的报警必须有记录、任何的偏差必须调查。,例如：cGMPCFR211.42设计及构造的特征作业在特定区域进行（无菌操作）,经过滤器过滤的空气向作业区供给,5.对过滤器的要求,5.1对气体和液体过滤器的要求常用气体过滤的疏水性材料PTFE（聚四氟乙烯），使用中必须干燥（应防冷凝水的堵塞和微生物的生
7、长）。常用药液过滤的亲水性材料聚砜常用注射剂用水过滤的亲水性材料PVDF（聚偏二氟乙烯）。上述材料常用作筒式过滤器的滤芯。FDA规定对用于无菌产品的过滤器应进行微生物挑战性试验、无菌过滤性能试验和完整性（起泡点）试验（使用前后）。其中微生物挑战性试验用户可以要求过滤器的制造商来完成，无菌用过滤器对数细菌减少量应7。过滤器必须进行周期性更换。在对无菌药液过滤器的验证中除了完成上述三项试验外，还应对过滤器的溶出物检查、过滤器的清洁度检查及与药液适应性试验（具体方法参见中国GMP验证指南中冻干粉针剂验证的有关内容）。,5.2对HEPA的要求HEPA的完整性必须维持无菌的生产条件，在安装时必须做检漏测
8、试。（美国联邦标准209A和209B指出：如果HEPA的泄漏试验和空气流速测试均合格，则洁净室的空气洁净度是不难达到的，此两项运行检验比在含极少微粒的部位进行微粒计数测定的做法更有意义，故其重要性不亚于粒子测定。）检测位置：边框、滤器表面。检漏方法：DOP气溶胶法和PAO气溶胶法（DOP邻苯二甲酸二辛脂、PAO聚烯烃）（DOP法因为有突变性，现国外已w全部改用PAO作为气溶胶烟雾剂）。取样速度和距离：每分钟1立方英尺(0.0283m3/min中国验证指南的取样速度为3 5cm/s)，气溶胶光度计的取样口应离滤器和边框表面约12英寸（0.0254m 0.0508m中国验证指南的距离为2 4cm）
9、。对于替代的烟雾剂应评诂其对微生物生长是否有促进作用，以排除替代的烟雾剂对HEPA造成微生物污染的风险。,HEPA的过滤效率应能够截留99.97%的大于0.33um的颗粒。无菌工艺的HEPA检漏应有适当的时间间隔确认，每年最少检查2次。当空气洁净度不合格或可能引起墙壁或屋顶结构变化的设施翻修或培养基灌装失败或药物无菌测试失败时，必须加做额外的检漏测试。HEPA检漏测试必须有完整的书面记录备查，一旦发现气溶胶光度计的读数0.01%时表明有泄漏，应及时更换或维修，更换维修后必须重新测试。通过HEPA过滤器的空气速度均一性的周期性确认非常重要，其速度的变化会造成紊流而增加污染的风险。其单向气流速度的
10、测定必须于距离过滤器表面约6英寸（15.24cm）处进行测试，或是在无菌操作关键区域内过滤器工作表面中心的确定距离内测定。如果检测为非单向气流或是有副作用的气流模式，都必须更换HEPA。,无菌环境的设计注意点/认证空调设备的设计认证（原FDA检察官提出事项）网框的间隙（无空气滞留）气流监控录像的保管,6.对洁净区整体设计的要求,总则：无菌工艺要求尽可能的减少潜在的污染。必须控制产品暴露的时限，提供最高级别的环境控制，优化工艺路线和防止低质量空气进入Class100的设备设计都是高度无菌确认的关键。优化人流物流，防止无必要的活动发生；设备的布局必须符合人体工程学的要求，优化操作工的操作；必须尽可
11、能的减少操作工人数；人流的设计必须尽可能限制人员进出无菌工艺间的频率；必须尽量减少关键区域和一般洁净区域或隔离器之间的传递次数；必须限制在关键区域旁的活动，以防止低质量空气的引入。,无菌工艺中所用的设备必须有适当的设计防止人为的干扰和打断（增加污染的危险因素）。如：使用在线称量装置可减少重复的手动操作，使用SIP灭菌处理预装备的连接可减少灭菌操作，其他工艺路线的自动化操作可降低产品污染的风险。产品必须在合适的洁净级别下进行转移。例如：冻干工艺的半压塞产品只能在关键区域内转移，设施设计必须确保灌装生产线和冻干机在Class100保护下，转移和御载操作也必须受到相同级别的保护。如果无菌工艺区或轧盖
12、前房间内有带塞小瓶（即未轧盖的产品），必须有局部保护措施防止产品受到污染，使用仪器在线检测装配不适当的塞子以提供额外的质量保证（待轧盖产品在运输过程中的塞子突起）。无菌隔离系统的使用可以更好的保护产品不受人为污染。,必须仔细定义和控制各房间之间的动态过程。可以使用双门或集成灭菌器确保低级别区到高级别区的正确合适的直接物流；使用气闸室和联锁门控制无菌工艺设施内空气压力，无菌制造区域入口处和其他无级别区的邻近处必须设气闸室；当人员和物料从低级别区域进入高级别区时应严格采取措施防止污染（如必要的洗手消毒、更衣、物料的灭菌等规程）。建造洁净区的材料必须容易清洗和消毒，如无缝和弧形设计的墙角、平整坚硬的
13、顶棚/墙壁/地板、不藏尘HEPA框架等。工艺设备和系统必须配备卫生装置和阀门。无菌工艺操作间内应不设下水道（地漏），如果不可避免，那么任何这样的设施都必须有设计说明。设备应便于安装拆御和无菌处理；不阻碍洁净区气流，在关键区不得打乱单向气流；对洁净区环境的影响必须有足够的说明；没有积累颗粒的水平表面和突起部位。因非正常情况导致的空气系统或其他设施的停机，以及建造活动对设施的影响等必须在偏差和变更控制系统中加以说明解释，必须有书面的程序说明在停机后如何恢复正常运行。,图例：1）.无菌操作的微生物污染控制,图例2）.环境区域划分和正确的更衣事例,三、人员要求,3.1操作人员质量部门必须为制造操作提供
14、常规的监督以确保操作人员的无菌操作始终符合已建立的书面规程。任何人在进入无菌操作区前必须接受如下培训内容的培训：消毒技术和更衣操作；微生物学和卫生学；精制包装行为准则；非无菌药物造成的病人安全性危害；无菌制造区域内的所有书面操作规程等。（以上内容的培训，在日常工作中，主管人员应每天评诂每个操作员工在实际操作中是否按书面规程操作。）,维持无菌物品和表面无菌状态的人员操作技术有：只使用无菌器具接触无菌物料，为防止物料间的交叉污染，应根据需要及时更换无菌器具；在更衣后无菌手套必须经常消毒或更换，应避免将衣物和手套直接接触无菌产品和容器；人员的移动必须缓慢，必须有目的的移动，应避免因漫无目的的移动而造
15、成的单向气流混乱；为避免无菌产品受污染，应确保操作人员的身体处于单向气流之外；操作人员进行的必需的无菌操作不得危害产品的无菌性，应避免垂直操作打乱单向气流，应避免在关键区域内说话；（通常从侧面的操作可以确保无菌产品周期的无菌条件）。无菌操作之前和整个过程中必须避免着装的意外污染（着装的维持和控制）。只有有资历的人员，穿合适的着装方可允许进入无菌操作区。,工作服必须进行消毒处理，且不得有丝织物脱落；着装（包括：面罩、面具、胡罩、防护眼镜和弹性手套）必须能够覆盖所有的皮肤和毛发，必须有书面的规程描述如何采用无菌方式使用这些着装品。一旦发现着装有破损或损坏必须立即更换。操作人员调任其他岗位应经过再培
16、训和取得上岗资格，这种情况必须有充分的书面规程规定。3.2实验室人员无菌技术和无菌制造人员的要求同样适用于进行无菌取样和微生物测试的实验室人员。如果实验室产生的各种数据存在问题，则操作和系统将不被认为是在受控和可重复的状态下。,3.3人员的监控程序操作人员是严重影响无菌产品的关键环节之一，必须建立高度预警且灵敏的人员监控程序。可通过获得每天每个操作工手套的表面样品，或者是每批生产的相关样品来建立监控程序。监控样品还应包括衣物上合理部分的合适取样频率下获得的样品。质控部门必须为那些复杂或是复杂的无菌操作环节的操作工建立一个更加全面的监控程序。对无菌操作人员的监控目标是始终维持在操作过程中保持手套
17、和衣物的无污染状态，单单取操作前的灭菌手套是不够的，因为在后续的操作中微生物会重新繁殖。一旦操作工表面微生物超过建立的规定标准或是显示出不利的趋势，必须立即进行调查。后续采取的措施应包括增加取样、增加观测、重新培训、再确认着装程序、特殊情况下的人员重新调整、安排指定的人员离开无菌操作区域。,四、对组分和密封件的要求,4.1组分无菌产品组分包括活性成分、注射用水和其他辅料。如果使用了一个或多个含有微生物或细菌内毒素的组分，则产品会被污染，因此对这些组分中的微生物载量和内毒素指标的确认及建立合适的可接受限度非常重要。非肠道产品要求无热源，因此必须有书面的规程和的规格标准来规定产品中每个组分的内毒素
18、可接受标准，任何内毒素不合格的组分都必须拒不使用。无菌制剂的组分通常单个灭菌或是多个组分混合后的混合物灭菌。常用的方法是将组分溶于溶剂中再于无菌条件下进行除菌过滤，或是将各组分分别溶解后单独无菌过滤最后进行无菌混合（此法适用于组分混合后最终产生大分子的混悬针剂）。过滤的药液再进行灌封或无菌结晶或冻干成粉末。对热稳定而又不溶解的组分可采用干热灭菌的方式，但必须小心的设计热穿透和热分布试验。,4.2容器/密封件制备非肠道产品所使用的容器具/密封件必须无菌、无热源，其灭菌方法必须符合它们的材质性质，其灭菌的有效性必须验证证明。对其灭菌后可保持无菌无热源的时间限度和再验证周期必须有书面的规定。无菌制剂
19、产品的容器具/密封件清洗的最后一道清洗剂必须是符合USP质量标准的注射用水。评诂去热源工艺的有效性方法：向容器/密封件中添加已知量的内毒素，然后去热源处理，再测定其残留的热源量，同时使用阳对照的方法计算内毒素的回收率。验证研究数据必须证明采用的方法可以将内毒素降低至99.9%（3Logs）。对玻璃容器一般采用干热方法灭菌和除热源，对此灭菌方法的验证必须包括热分布试验、热穿透试验和使用最短的消毒时间。容器的放置必须与实际生产相一致。非肠道制剂所使用的塑料容器也必须是无热源的。,橡胶密封件（胶塞和注射器活塞）在进行纯蒸汽灭菌前的最初清洗水至少使用符合USP最低内毒素的纯化水，最后冲洗水必须是注射用
20、水。使用热注射用水多次冲洗可以达到去除热源的目的。为防止微生物滋生的污染，橡胶密封件灭菌后必须彻底干燥，其含水量应符合规定标准。对清洗灭菌的过程必须进行验证，以确认这些物料上的内毒素被完全去除。必须特别注意硅化处理过程是胶塞的潜在污染源，其所用的硅油（聚硅氧烷）必须符合一定质量规格，必须对制剂产品的安全性/质量/纯度不产生副作用。采用的这些容器/密封件的合同制造商必须符合cGMP的要求，制剂生产商必须审核合同制造商的验证方案及最终的验证报告。对已建立供应商质量审计体系（定期测试）的合同制造商可以在外观测试和对方COA（检验证书）的基础上接受容器/密封件。,微生物能够穿透的密封件不适合无菌产品的
21、生产。对最后分装好的产品的检查中发现任何被破坏或有缺陷的单个容器必须检出并被销毁。必须严格保证运输过程中容器/密封件的完整性，必须防止由于包装破损造成的非无菌污染。设备适用性问题或购入的容器/密封件质量缺陷都会造成容器密封系统的不完整，如果危害是由于没有及时检出而造成的完整性破坏，必须立即改善这些系统。递送装置（如灌注装置）的功能缺陷，使递送的体积不一致，同样可以导至产品质量问题，必须采用合适的中控方法进行监控。任何与中控或最后检查不一致的或超出范围的结果都必须按照21CFR211.192的条款进行调查。,五、对内毒素的控制,注射产品的内毒素污染是不好的GMP控制造成的。药物成分、容器/密封件
22、、储存时间限制和制造设备都在内毒素的控制范围内。设备的充分清洗、干燥和保存可以控制微生物的载量，防止内毒素的载量增加。设备必须设计成容易拆御/装配/清洗/消毒或灭菌。如果没有足够的控制方法，产品中的内毒素将会由上下游的设备而增加。无菌级别的过滤器和湿热灭菌不能够有效的去除内毒素。对设备内表面的内毒素可以采用高温干热灭活，或采用清洗程序去除内毒素。一些CIP规程可以先使用合适的高纯水或洗涤剂（如稀酸稀碱、表面活性剂）初洗，最后用热的注射用水冲洗。清洗灭菌的设备除非立即进入无菌操作的过程中，否则在清洗后必须进行干燥。,六、生产时间限制,根据21CFR211.111条款：无菌工艺的每步操作都最好设定
23、时间限制；时间限制必须包括：大批量产品的配制和灭菌时间间隔、过滤工艺时间间隔、产品暴露在生产线上的时间间隔、无菌设备/容器/密封件的保存时间限制等。不同产品生产环节的时间限制的建立必须有数据支持。生物载量和内毒素载量必须在建立配方加工阶段的时间限制的时候进行评诂。产品过滤的总时间必须建立，以防止微生物穿过过滤器。这个时间限制也可以防止上游的生物载量和内毒素载量的增加。如果过滤器可以提供微生物吸附的基底，必须确定和合理解释其最多的使用次数。,七、对无菌工艺和灭菌方法验证,7.1模拟无菌工艺研究研究方法的设计为确保产品无菌，应对其无菌灌装和封口操作及灭菌方法进行验证，必须进行“培养基灌装试验”用培
24、养基替代产品模拟整个工艺过程（包括生产环境），确认培养基是否在工艺过程中被污染。原则：综合考虑生产线上所有潜在的污染源，评诂工艺控制的有效性，考虑最差的情景模拟，挑战极端的环境等。必须有完整的批记录，环境监控记录等支持这样的模拟研究，必须书面定义条件的选择原因。不应该用产品灌装试验作为引入潜在污染操作行为的依据。研究设计应考虑的要素：生产线允许的最长时间范围，可造成潜在污染的相关因素（如员工的疲劳）；人员数量及操作活动；,每次运行中的常规中断操作次数、类别和复杂程度以及非常规的中断操作和干扰事件（如维护、停产、设备调整）；设备的无菌装配；无菌分装和冻干过程；有代表性的无菌加料（如容器/密封件和
25、无菌组分的添加）和转移操作的次数；班次变化、中途休息和合适的更衣次数；无菌设备连接/断开的类别；无菌取样操作；生产线速度和构造；称重；容器密封系统（如大小、类别、设备兼容性）；书面规程中的无菌工艺相关的特殊限定（如CIP指令前的环境要求）,模拟研究运行次数和频率：在最初的确认时，至少应进行三次连续且独立的模拟。日常每半年重复一次，以评诂其控制能力；每班的代表性活动和中断操作、换班都必须在半年确认程序中涵盖；所有被授权进入无菌工艺间的人员（包括技术工人和设备维修人员），都必须每年至少参加一次无菌灌装测试，参加者的操作都必须和其日常工作相一致；每次产品或生产线的变化都必须有书面的变更控制系统评诂。
26、任何可能影响无菌工艺性能的变更或事件都必须增加额外的培养基灌装试验来评诂。如设备设施的改变、生产线构造的变化、人员重大变化、环境监控结果的异常、容器密封系统的变更、延期的关机或最终成品无菌检查显示产品被污染等都可引发对系统的再验证；一旦灌装试验数据表明工艺不受控，必须对污染的起原和问题涉及面进行调查。一旦制定的整改措施，就必须进行模拟试验以确认缺陷已经被修复，工艺已回到了受控状态。当调查得不出有说服力的结论时，在加强监控的前提下连续进行三次成功的生产就可以了。,模拟研究运行持续时间以最大批量和运行时间基础上灌装试验是最真实的模型，若采用任何其他的合适模型都必须进行合理的解释。灌装试验的运行持续
27、时间必须考虑实际操作时间和中断操作的时间。一般性发生的中断操作必须在日常模拟中涵盖，那些不经常发生的中断操作可在周期性的模拟中确认。如果无菌工艺中有一定操作工的手工操作，在模拟工艺中此类操作持续的时间不得少于实际的制造工艺时间，以尽可能的模拟由于操作工所引入的潜在污染风险。对于冻干操作，FDA建议使用不封闭的容器暴露在部分抽空的设备内来模拟正常工艺，不需冷冻产品，必须小心操作确保培养基处于有氧状态，以避免抑制潜在的微生物生长。模拟研究生产线速度培养基灌装试验程序必须充分解释生产期间的生产线速度范围，每次培养基灌装操作必须评诂一个生产线速度，必须对选择的速度进行合理的解释。,模拟研究环境条件：培
28、养基灌装试验必须在足以代表实际的生产环境下进行。人为特别控制条件下的灌装将导致不正确的评诂。在SOP允许的“压力条件”（如最大工人数和提高的运行水平）内，灌装试验涵盖这些挑战是非常重要的，也支持了这些研究的有效性，此所谓的“压力条件”不包括人为制造的极端环境条件（如将HVAC系统调整为最差条件）。模拟研究的培养基要求：一般情况选用大豆酪蛋白消化液培养基，特殊情况选用厌氧菌培养基（硫代硫酸盐培养基）。选择的培养基必须证明能够促进G、G、酵母菌和霉菌（以及USP生物指示剂）的生长。USP生物指示剂是否足以代表生产相关的菌种必须由QC实验室决定。环境监控和无菌测试的菌种必须用于促生长的挑战性试验，菌
29、种的接种单位必须100CFU。如果促生长试验失败，模拟试验中发现的任何污染的来源应进行调查，培养基灌装试验必须立刻重新进行。,每个单元都必须灌入合适数量和类别的培养基，并确保其接触到容器的内部（倒置或旋转），以便目测观察微生物的生长。灌装完成后进行外观检查，所有完好的单元必须立即进行培养，有完整性缺陷（如无塞/破瓶等）的必须抛弃。培养基单元必须在足以检测到最难生长的微生物条件下培养，根据以下思想选定培养条件：培养温度必须符合生物载量和环境中菌种的生长，一般不超过2035（通常菌种都有规定的培养温度范围），培养时必须维持在目标温度的2.5 内；培养的时间不得少于14天，如果灌装的培养基连续使用两
30、个温度点培养，则每个单元在每个温度的培养时间不得少于7天；培养基单元是否被污染必须由具有合适教育背景、培训和经验的人员负责进行检查。如果QC不负责具体检查，也必须在这样的检查时现场监督。所有检查时发现的可凝单元都必须交给QC微生物学家。为方便目测观察微生物生长情况，FDA建议采用的容器为透明色。,培养过后任何被破坏的单元必须和灌装过程中损坏的单元一起计数，从最终计数中排除这些单元的决定都必须全面解释，并在培养基灌装报告中作为偏差解释。如果发现在很难检测损坏与微生物污染之间有必然的联系，必须进行完整的调查来查明原因。如果书面程序和批记录中描述了在培养基灌装试验中可以被移出的单元或清除率，则这些被
31、移出的单元不必进行培养。千万不要在灌装试验中移出比实际生产中更多的单元。制造商没有必要担心培养基灌装对生产设施和设备造成潜在污染，因为如果培养基被正确处理、并立即清洗和消毒，甚至对设备灌装系统进行灭菌，则后续产品的生产没理由被影响。大数量的在线清除不应该影响培养基灌装试验模拟正常生产来检测潜在的污染能力。必须为收率和物料平衡建立合适的可接收标准，培养基灌装记录的物料平衡记录必须包括每批的总数目以及详细描述拒收单元的情况。,模拟研究实验结果的解释：工艺模拟的运行必须在QC部门的监控下进行，污染单元的数量必须和灌装试验模拟的时间和活动相一致。使用摄像机记录可以帮助确认人员操作对于灌装实验中的无菌工
32、艺没有负面的影响；任何被污染的单元都被认为是不好的且需要调查的。相关的染菌必须鉴定出其种系，必须调查污染的可能原因。无论灌装运行批量多大，只要模拟运行中发现了污染，就必须认为存在着潜在的无菌保证问题。灌装试验的总数和被污染的数目没有直接比例关系。测试结果必须可靠且可以重复的表明无菌工艺操作生产的产品是无菌的。在合理设计的设施内的当代无菌工艺操作被证明可以达到零污染率，且一般不会导致培养基灌装试验被污染。,推荐的可接受标准：,对于任何批量的大小，灌装试验中间断的发生微生物污染应意味着存在低级别的污染问题，是必须调查的。对于一条生产线上重复发生试验污染事故，无论是否符合接受标准，都是一个信号表明无
33、菌工艺生产线的不好趋势，必须确认问题、改正和再验证。模拟灌装试验的可接受标准允许有少量的污染，这并不意味着无菌产品的批号中可以存在着非无菌单元。（美国食品药品化妆品法案规定：禁止制造商出售任何非无菌制剂产品）。只有书面规程要求市售产品批号必须在相同方法处理的情况下发生的灌装试验失败可以被放弃考虑。对于这样的情况必须有支持的文件和合理的解释。,7.2过滤效率过滤是药品溶液无菌处理的常用方法。无菌级过滤器必须验证可以从工艺流中重复去除活的微生物来获得无菌液体。无菌过滤器的孔径应0.2um，可以使用一级或多级过滤器。无菌过滤验证中必须包括模拟最差生产条件下的微生物挑战试验和过滤器完整性测试。应选择代
34、表最差情况的生物指示菌评诂其去生物载量的能力，微生物挑战试验常用的指示菌为缺陷假小单胞菌（Pseudomonas diminuta ATCC19146)，它的直径为0.3um。灭菌前产品的生物载量必须检测以确定潜在污染微生物的趋势特征。挑战试验所需生物指示菌的浓度至少为107CFU/cm2（则验证所需指示菌数量过滤器滤膜有效表面积107CFU/cm2），使用此浓度的目的是为实际生产提供一个安全界限。,因为过滤器膜上通常有些孔径比一般孔径要大，有可以使微生物通过的风险，此风险随微生物数量的增加而增大，因此挑战试验的微生物数量非常重要。直接在产品中使用生物指示菌过滤并培养，虽然是最好的方法，但是如
35、果药物本身具有抗菌作用或是在油性配方中则会导致错误的结论。只要有充分的理由，过滤器对药物制剂配方的有效性可以使用合适的替代方法来评诂，但替代产品不能含有抗菌成分，且模拟的工艺和生产条件必须相同。任何使用与实际产品及工艺条件的模拟物所产生的任何分歧都必须进行合理的解释。,可以影响过滤器性能的因素包括：被过滤物质的黏度和表面张力；PH值；被过滤物质或配方组分和过滤器的相容性；过滤压力；过滤速度；最大使用时间；过滤温度；渗透性（重量渗透浓度表示）；液压减震效果。在设计无菌过滤验证方案时说明过滤器所允许的极端工艺参数非常重要，一旦过滤验证过于复杂，超出了使用者的测试能力，就必须委托测试或交由滤器制造商
36、测试。但是滤器使用者必须审核过滤验证报告来确保其达到工艺的用途，其数据必须与使用者的产品和生产条件相一致（因为滤器的性能在不同条件下对不同的产品有很大差异）。一旦过滤器被验证通过后，就必须保证实际生产过程中使用相同类别的过滤器。无菌过滤器必须在每批生产后更换，对那此可以重复使用的情况必须进行合理解释，其无菌过滤验证必须包括最大的可处理的批数。,无菌过滤器应进行完整性测试，其测试必须在过滤工艺开始前和结束后均应进行，以确认其使用前和使用后是否有泄漏和穿孔，可以采用前置流速和起泡点测试来确认其完整性。生产中过滤器完整性测试的规格标准必须同细菌截留验证研究产生的数据相一致。7.3设备/容器/密封件的
37、灭菌确认和验证接触无菌产品、无菌容器和密封件的设备表面都必须无菌。靠近无菌产品的表面，只要有理由怀疑其有潜在污染的可能，都必须保持无菌状态。这些关键设备的无菌处理工艺验证与产品/容器密封件的无菌工艺验证同样重要，最广泛的方法是湿热和干热灭菌。无菌工艺设备的无菌处理必须每批进行。灭菌后，设备/容器/密封件的传送、装御都必须严格按照无菌操作的方法进行保护和维持产品的无菌状态。验证研究必须可以证明灭菌周期的有效性，且必须进行周期性再确认。指定的装载方式、生物指示剂和温度探头的位置必须在验证中有记录。生产批记录的规定必须和验证的装载方法一致。,必须评诂灭菌器或设备（使用SIP的设备）内部潜在的很难达到
38、的位置（通常说的灭菌器的冷点区），用空载和负载试验来确认其内部不同位置的条件均匀性（如温度和压力），这些均匀性研究或参数布局研究必须使用校验过的仪器进行。热穿透试验必须使用已经建立的负载模式进行评诂，以确定不能有效达到灭菌致死率的热物质穿透难度。用放置在温度传感器附近的生物指示剂来评诂微生物致死率与基于输入热量的预期致死率之间的关系。当确定什么物质特别难灭菌时必须注意过滤器/泵和灌装系统的灭菌。最终，这种灭菌方法的灭菌周期标准必须依据达到足够灭菌能力的最低位置所需的时间来定。必须证明灭菌方法可以达到使微生物下降至10-6或是更好的情况。灭菌器的验证程序必须持续关注最冷点和最难穿透的部位，其合适
39、性必须建立在确认/维护/变更控制和周期性确认（涵盖微生物挑战）的基础上。变更控制程序必须足够说明负载情况的变化或是灭菌器的结构改变。,设备控制和仪器校验无论是验证还是日常监控，灭菌监控设备产生的数据可信性都是至关重要的。测定灭菌周期参数的设备都必须进行日常校验。必须建立书面的规程来确保这此设备处于校验的有效状态，FDA建议的规定如下：热法灭菌中使用的温度和压力测定仪器必须进行日常周期性校验，且间隔必须合适。验证中使用的传感器必须在验证的前后都校验；用于监控灭菌器灭菌时间的仪器必须周期性校验；生物指示剂使用的微生物计数器必须确认，且生物指示剂必须保存在合适的条件下；如果供应商的COA的可靠性已经
40、通过合适的确认程序确认，则生物指示剂（如胞子试纸，玻璃安瓿）的D值可以在每批确认后接受。否则必须对接种到灭菌物质中的生物指示剂D值进行测定，或是采用供应商提供的方法之外的其他方法来测定。D值测定可以使用独立的实验定完成。蒸汽纯度测定的仪器必须校验；对于干热灭菌隧道，测定传输带速度的仪器（如传感器和发送器）必须周期性校验；内毒性挑战试验必须由实验室合适的配制和测定。,为了确保灭菌设备的人工控制，必须适当的设计设备，注意诸如灭菌介质可达性能、管道坡度、冷凝水完全排除等性能。设备控制系统必须确保通过哪些安装在可以快速反映工艺变化位置的测量仪器来实现。哪些灭菌器或SIP操作中需要人工手动控制的阀门操作
41、，都必须在制造规程和批记录中记录下来。灭菌设备都必须进行合适的维护以确保其连续和满意的功能。灭菌器性能特性的日常评诂（如平衡时间对于确保灭菌单元始终按照验证条件进行连续的运行）是非常重要的。,八、实验室控制,8.1环境监控一般的书面程序无菌工艺中环境监控程序是非常重要的实验室控制之一。此程序不但为无菌工艺环境质量提供了有意义的信息，还为相邻的洁净区域提供了环境变化的趋势数据。环境监控必须可以及时的确认潜在的污染源，允许在产品被污染前实施整改措施。洁净室内空气和表面质量的评诂必须从书面定义好的规程和科学的测试方法开始。监控程序必须涵盖所有的生产班次，包括空气、地板、墙壁和设备表面及那此可能接触无
42、菌物料、容器和密封件的关键表面。取样点位置必须以书面程序说明，取样时间、频率和位置都必须在无菌工艺设施的监控环境内用科学合理的方法进行。取样量大小必须足以使环境污染的监测最优化，以满足其符合规定的洁净级别。,书面程序中说明微生物最大风险的位置非常重要。监控关键区域的微生物质量来决定灌装和封口操作中是否保持了无菌状态是尤为重要的。可以在重要的操作活动或是生产中产品暴露位置进行空气和表面取样。与无菌产品接触的关键表面必须在操作过程中始终保持无菌。当设定关键取样点时，必须考虑这些点在工艺中的污染风险，包括装备困难、工艺操作持续时间、中断影响等因素。关键表面的取样操作必须按照无菌工艺运行的要求来防止直
43、接接触无菌的表面。关键区域检出微生物污染的结果不一定要成批拒收，必须立即对操作运行信息和数据进行调查，必须注意有可能存在的极低概率的假阳性情况发生。环境监控检测方法不可能一直有效的检测出取样区域的微生物，特别是那些低水平污染很难监测到的区域。由于假阴性可能发生，连续的微生物生长检测结果只是一种不利趋势。在给定时间内，污染发生率的增加是一样或是更加值得关注的趋势。在缺少任何不利趋势的信息前提下，单一超出行动限的情况都必须进行调查和评诂，并决定是否需要采取任何合适的补救措施。在所有的洁净级别中，都必须在发生不良趋势时采取适当的补救措施。,所有环境监控点的位置都必须在SOPs中详细描述，以确保可以在
44、相同的地点重复操作。书面规程必须涵盖以下信息：取样频率；取样时间（如运行到什么阶段进行取样）；取样过程所用的时间；取样量（如表面积、空气体积）；特殊的取样设备和技术；警告限和行动限；超出警告限和行动限后的合适反应；建立监控标准和趋势分析程序微生物取样标准必须根据取样点位置和操作的相关性来确定，这个标准必须可以确保整个无菌制造设施内的微生物受控。可以参考历史数据库、培养基灌装试验、洁净区确认和清洁卫生处理研究的数据来建立这个标准。可以使用相类似的运行数据来设定警告限和行动限，尤其对那些新的运行操作非常适用。,环境监控的数据必须为制造环境的质量提供信息。每个单独的测试样品结果都必须与警告限或行动限
45、进行比较，分析其有效性。使用检测结果的平均值会掩盖不可以接受的位置的情况。达到警告限的数据必须立即采取行动，达到行动限的结果必须立即采取调查。必须建立书面的程序，详细描述审核的频率和采取的行动。质量控制部门必须对环境和人员监控数据进行日常短期监督（如每天、每周、每月、每季）和长期趋势分析。趋势分析报告必须包括每个地点、每个班次、每个房间、每个操作人员和其他参数产生的数据。质量控制部门必须负责对任何超标进行调查并编写相关的数据报告（如一年内指定的微生物调查研究）并确定后续合适的整改措施。微生物种类的明显变化必须考虑进行环境监控数据的重新审核。书面操作程序必须定义进行周期通行监控结果、趋势分析和调
46、查结果给最高负责经理的程序系统。,消毒效率消毒剂/消毒方法的适应性、有效性和局限性都必须评诂。这些消毒剂/消毒方法的有效性必须根据其确保潜在污染可以彻底从表面去除的能力大小来测定。为了避免引入新的污染消毒剂必须无菌，且存放在适当的（无菌）容器中并在书面程序预先规定的最长时间内使用。日常使用的消毒剂必须可以有效的抑制那些菌丛恢复的实验室内常态的微生物生长。许多常见的消毒剂对孢子无效（如70%的异丙醇对芽孢杆菌Bacillus upp的芽孢无效）。所以有效的消毒程序必须包括一个能杀孢子的物质，当发现环境中存在孢子有机体时，必须按照书面规程的方法消毒。消毒操作程序必须详细描述（如配制方法、使用频率和
47、接触时间）以确保能够重复。一旦建立了方法，必须使用日常监控程序来评诂其有效性和充分性。一旦发现微生物相关的不良趋势，必须调查确认洁净室内分离到的微生物对洁净室内使用的消毒剂的敏感性。,监控方法可接受的监控微生物学特性的环境包括：A、表面监控环境监控涉及不同表面的微生物质量取样测试，如产品接触的表面、地板、墙壁和设备表面都必须测试。可以使用接受皿和擦拭法来进行这类试验。B、主动空气监控对空气的微生物质量进行评诂可能涉及使用活动的设备，包括但不限于如压缩机、离心机和膜（或明胶）取样器。每种设备都是测定一定体积内的有机体数量，但是又都有优点和缺点。FDA建议每生产班次都在选择的位置使用这些设备来评诂
48、无菌工艺生产区域环境的好坏。制造商必须知道这些设施进行空气监控的能力，取样器必须在收集效率、洁净度、消毒难易及对单向空气的影响大小的基础上进行选择。因为设备各不相同，故使用者必须在其正式使用前进行全面的实用性检测。制造商必须这些设备被校验且正确使用。,C、被动空气检测（沉降菌检测）本方法使用的是被动的空气取样器，如沉降皿（将含有营养培养基的培养皿敞开放置在环境中）。因为可以监测到那些降落在培养皿上的微生物，所以沉降菌检测方法可以被作为定性或是半定量的空气监控方法。关键区域的沉降菌数据会因为将培养皿放置在高污染风险的地方而提高。做为方法验证的一部分，质量控制实验室必须评诂培养基在什么情况下可以有
49、效的获得低级别的环境微生物。暴露的环境必须预先防止漫干燥作用（如漫长的取样时间或高的气流速度）而妨碍微生物的生长。被动空气取样的数据可以和其他取样方法获得的数据一起来评诂。,8.2微生物培养基及微生物鉴别检测出来的微生物特性提供了环境监控程序的关键信息。环境中分离获得的微生物一般和培养基灌装试验或产品无菌测试发生的污染物以及环境监控的全面信息为调查提供了非常有价值的信息。关键区域及其直接接触区域人员的监控必须包括微生物种类的常规鉴别。一般情况下，环境趋势的数据可以揭示出非受控或低级别受控区域的微生物污染了无菌工艺区域。为低级别控制的洁净区域，如10万级（ISO8）区域，设立足够的规程就可以检测
50、出这样的趋势是否存在了。至少必须有规程来鉴别辅助区域环境内（周期性检测）发现的微生物种类，从而建立一个有效的数据库来反映生产中可能存在的微生物数据库，并证明清洗和消毒操作的持续有效性。,已知的基因鉴别方法比传统的生物化学和形态学技术更加准确和真实的鉴别微生物的种类。这些方法在失败调查（如无菌测试/灌装研究污染）中有特别的价值。然而，合适的生物化学和形态学技术可以用于日常微生物的鉴别。微生物监控的目的是为了重复监测微生物，以监控环境控制状态。稳定的方法可以产生一个数据库，可以使数据比较和解释更加合理。用于环境监控的微生物培养基必须验证在一定的温度和时间下，适合于检测真菌（如酵母菌和霉菌）和细菌。
