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1、第二章植物细胞的获取,第一节外植体的选择与预处理,成功关键：培养基及培养条件、外植体的来源。一、外植体的选择从生长正常，无病虫害的母株中，选择适宜的组织器官1、用于直接分离细胞的外植体的选择原则：细胞之间粘连程度较小；叶片最佳；限制：机械或酶伤害细胞，完整细胞较少。,2、用于愈伤组织诱导的外植体的选择双子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶、叶片、根等。单子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、细穗、花药等。无论是双子叶植物还是单子叶植物、均以幼胚诱导愈伤组织的为最佳。因为幼胚诱导的愈伤组织质量最好，分化能力强。基因型的影响：不同种类及不同品种之间存在差异；,同一植物，不同部位脱
2、分化和再分化能力存在差异：百合：外层内层；紫草根茎叶；苹果顶芽褐变程度侧芽；兰科：茎尖；还要考虑生产目的：选用植株中主要生产所需的的次级代谢产物的组织和器官,2、用于愈伤组织诱导的外植体的选择外植体的生理状态：红豆杉：新生的嫩枝；取材季节：母株生长旺盛的季节；紫草：秋天（紫草宁合成和积累）；外植体大小：适当大小；脱毒率和茎尖大小及成活率之间的关系；,3、用于分离原生质体的外植体的选择分离原生质体则以叶片为最好。苗龄与叶龄有关；太老不易游离，太嫩，易游离，但细胞膜易损害；以苗龄1525d，刚展开的幼叶为最佳。无菌苗幼叶；还要考虑培养目的；多数情况下，需要根据实验确定；,4、花粉材料的选择用作花粉
3、培养的亲本植株的基因型、生长情况以及接种时花粉所处的发育时期，对花粉植株的诱导频率都有直接的影响。关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。,四分体小孢子单核花粉双核花粉,花粉的发育时期,花药培养属于器官培养范畴,花粉培养也称为小孢子培养。是从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离的状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.属于细胞培养的范畴,1、外植体的灭菌处理常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较表,二、外植体的预处理,几种常用消毒剂的
4、效果比较,外植体表面灭菌过程：,选材刷洗、冲洗用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动自来水冲净洗衣粉水 70酒精浸泡1030秒振荡 0.1升汞310分钟(表面活性剂)无菌水冲先35次 接种,2、外植体的其他处理,目的：提高愈伤组织诱导率；促进原生质体游离。方法：预培养；暗处理；低温或高温处理；萎蔫处理；抗氧化剂处理；高渗透压预处理；,花药和花粉培养的预处理：最常用的方法是低温冷藏。具体做法是将带有叶鞘的穗子或花蕾用湿纱布包裹后再用塑料袋套起，放在冰箱中冷藏。不同材料对处理温度的高低有不同的要求，一般耐寒植物比喜温可耐受较低的温度。低温处理时间视使用的温度而定，较低的温度处理时间要短，反之则长。烟草79度
5、下处理714天，水稻710度下处理1015天，大麦37度下处理714天，都可显著提高花药的出愈率。,低温处理的作用：,预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），产生两个相等核，进而形成愈伤组织或胚状体。保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老。激发花粉产生原胚。促使细胞同步分裂。,技术要点,第二节从外植体直接分离植物细胞,一、机械捣碎法将外植体捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞。优点：不用酶，细胞不会受到伤害；没有经过质壁分离，利于生理生化研究。缺点：机械作用，细胞结构破坏大，得率低。最佳材料：叶片,
6、方法及步骤：第一种方法：用刀片刮叶片第二种方法：先把叶片轻轻研碎，然后通过过滤和离心净化细胞。叶片表面灭菌切成小于1cm2的小块玻璃匀浆管中匀浆过滤（孔径分别为：61m和38m）低速离心，弃上清悬浮细胞细胞培养,二、酶解法,利用果胶酶、纤维素酶等处理，分离出具有代谢活性的细胞；该法不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。所以在用酶解法分解细胞的时候，必须对细胞给予渗透压保护。常用的渗透压保护剂是甘露醇。首次成功：烟草叶细胞步骤：叶片表面灭菌撕去下表皮切成4cm2小块放入酶液中抽真空摇床上酶解每30min更换一次酶液（第一次弃去，第二次主要含海绵细胞，第三、四次主要含栅栏细胞）收集细胞，培养基洗二
7、次后培养,机械法和酶解法比较机械法：细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离，有利于进行生理和生化研究；容易伤害细胞结构，获得完整细胞团或细胞数量极低；细胞易破。酶解法：细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。,第三节通过愈伤组织诱导获取植物细胞,一、获取过程：（1）诱导产生愈伤组织；（2）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性。（3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物。具体方法：用镊子或小刀分割得到植物小细胞团；液体培养基中加入小玻璃珠，振荡培养，使其分散，再过滤获得；适量的果胶酶可促使细胞分开。在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三
8、个时期：启动期、分裂期和形成期。,启动期是指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长素对诱导细胞开始分裂效果很好。常用的有：2,4D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。通常使用细胞分裂素和生长素比例在1:l或是小于1来诱导植物愈伤组织的形成。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞等等。,外植体的细胞经过启动、分裂和分化等一系列变
9、化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（24个星期）将它们分成小块接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。即经常地继代培养。,二、影响愈伤组织诱导的因素1、外植体：细胞越成熟，脱分化越困难。无菌萌发的幼苗。2、培养条件：1）激素的种类及浓度：生长素：2,4D、IAA、NAA；细胞分裂素：KT、ZT、6BA。2）培养基的种类,3）光照和温度（210.3）最佳。4）NH4/NO3-5）碳源良好的愈伤组织的条件：高度的胚性或再分
10、化能力；容易分散，以便建立优良的悬浮细胞系和分离原生质体；旺盛的增殖能力，以便建立大规模的无性系；继代不丧失胚性,黑暗培养下烟草的愈伤组织,继代培养常见问题,1.变异问题 影响变异的因素：基因型 发生途径 继代次数 减少变异的措施：选择变异率低的品种 选择不容易产生变异的发生途径 严格控制继代代数（10代以内）,继代培养常见问题,2.玻璃化问题玻璃化现象产生的主要原因：一是通气不良；二是激素浓度太高；三是基因型；四是水分。培养基中可利用水的含量过高，试管苗可吸收的水分太多，植物内具有过多的游离水。克服玻璃化现象的措施：两个“增加”：增加琼脂浓度；增加蔗糖含量；两个“增强”：增强溶器通风；增强光
11、照；两个“加入”：加入渗透剂；加入ABA（脱落酸）；一个“减少”：减少培养基氮含量。,第四节通过原生质体再生获取植物细胞,原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。,第四节通过原生质体再生获取植物细胞,关于原生质体研究的重要成就：1880年，Hanstein首次起用原生质体一词。1960年，Cocking首次应用酶法制备番
12、茄根原生质体获得成功。1971年，Takebe 首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。1985年，Fujimura 第一例禾谷类作物水稻原生质体培养再生植株。1986年，Spangenberg 单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。,一、植物原生质体的材料来源,几乎能从植物的所有部位得到原生质体，其中以叶片为多，因为植物叶肉细胞的原生质体有下面几个优点：1.取材容易，植株可来自盆栽和温室栽培，也可在试管中培育无菌苗。2.原生质体在生理和遗传特性上比较一致。3.比较容易用酶解法分离。根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。花粉经特异酶处理也能得到原生质体，
13、在单倍体遗传育种中有特殊的用途。,二、植物原生质体的材料来源,原生质体也可以从组织培养的材料中大量获得。由于组织培养的严格条件，使得材料的重复性好，实验材料可做到常年供应。值得注意的是，在考虑分离植物原生质体时，既要采用容易获得原生质体的植物材料，但更重要的是要选用易于再生完整植株的细胞。,二.植物原生质体的分离和纯化,(一)原生质体的分离早在1892年就有人用机械法分离原生质体。直到1960年，英国的科金(Cocking)首先采用酶解法分离原生质体。酶解法有下面几个优点：能获得大量的原生质体；条件温和，原生质体完整性好；原生质体纯净度高；下面以叶片和悬浮培养的细胞为材料介绍分离原生质体的一般
14、步骤。,1.材料准备与表面灭菌2.酶解：用镊子撕去叶子的下表皮后，切成2厘米见方的小片，使去表皮的一层朝下放入酶液中处理，在25-28，黑暗下酶解3-4hr。若采用悬浮培养的细胞，则采用继代3d的细胞最好，经离心收集细胞，放入酶液中置低速转床酶解8-12hr。,(二)原生质体的纯化,酶解后纯化原生质体的步骤如下：1.酶解悬浮液用400目的不锈钢或尼龙网过滤，以除去未消化的碎片。2.将含有原生质体的酶液收集到离心管中，低速离心使原生质体沉于管底，倒掉上清液。3.在离心管中加入适量的洗涤液，并离心。4.重复上述操作三次，使酶解液充分除去，最后用原生质体培养液洗涤一次。上述的离心纯化法可细分为：A沉
15、降法；B漂浮法；C沉降法和漂浮法结合等三种。,原生质体培养基,分离时酶的溶剂为原生质体培养基甘露醇和蔗糖为渗透压调节剂在酶液中加入适量的氯化钙和磷酸二氢钾作为原生质体稳定剂，可增强质膜的稳定性,酶溶剂用原生质体培养基或特殊配制,(三)原生质体的活力测定,一是目测法：凭借形态可识别原生质体的存活性。二是采用特异的染色方法来确定：0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能吸收而呈红色，死的则无此能力；伊文思蓝与之相反，仅死原生质体可吸收；荧光素双醋酸酯(FDA)染色，FDA本身没有荧光和极性，可自由渗透进出完整质膜。活的原生质体的酯酶能分解FDA成为具有荧光的极性物质，无活力的不产生荧光。,Befor
16、e protoplasts can be cultured it is necessary to test them for viability.,三.影响原生质体分离的几个因素,1.酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压等。不同细胞细胞壁组成和结构有差异，故酶的种类和浓度也不相同，如分离根尖细胞要有较多的果胶酶；花粉母细胞及四分体小孢子：蜗牛酶及胼胝质酶联合；成熟花粉细胞：果胶酶和纤维素酶。酶液pH值也直接影响分离的速度和稳定性。pH值低则分离速度较快，而损坏的较多；pH值高则分离速度较慢，而完整性较好；故酶液的pH值一般为5.7左右。,三.影响原生质体分离的几个因素,2
17、.渗透压稳定剂种类和浓度因材料不同而有变化。在酶液中加入适量的CaCl2和KH2PO4作为原生质体稳定剂，可增强质膜的稳定性。3.取材植株的生理状态也是重要的因素，如采用悬浮培养的细胞一般用继代3d的较为理想。,四.培养原生质体的几种方法,原生质体经分离和纯化后，需要进行活力测定和计数。原生质体培养时有一种密度效应，一般1045个/mL有利于培养。计数可用血球计数板进行。,Brassica protoplasts,The optimum plating efficiency(tobacco protoplasts)5104 protoplasts/cm3.Protoplasts fail to
18、 divide when plated at one tenth of this concentration,液体浅层培养,将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。优点：操作简单，对原生质体的操作小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：使原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。,固体平板培养,固体培养也就是琼脂瑭包埋培养。低融点的琼脂糖可在30左右融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，
19、易于统计原生质体分裂频率。缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必须合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快，原生质体不易混合均匀。,液体固体双层培养,即在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。,琼脂糖珠培养,将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50微升一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上
20、低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。,第五节 通过花药获取花粉粒,花粉的分离有二种方法，即花药漂浮培养自然释放法和机械分离法。（1）花药漂浮培养自然释放法：把花药接种在液体培养基上，花药漂浮于液体表面经17天的培养，药壁自然开裂，花粉自然散落下来，及时将花药壁从培养瓶中取出来，留下的花粉继续培养，如水稻、大麦等。,（2）机械分离方法分离：把花药放在玻璃容器中，加入一定量适当浓度的蔗糖溶液或适量液体培养基，用注射器内径轻轻挤压花药把花粉挤出来，或用磁力搅拌器把花药搅裂使花粉散出来。过筛：将上述混合液经过一定孔径的不锈钢网或尼龙网过滤。一般孔径应比花粉直径大10um左右，将滤液离心，去上清液。清洗：加入蔗糖液或液体培养，置1001000转/分离心15分钟，再去上清液，如此重复23次。最后一次用需用培养花粉的液体培养基进行，以保证培养基成分的稳定性。培养时花粉的密度一般为104105个/ml。,谢谢观看,
