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1、第七章 植物脱毒和快速繁殖技术,组员：贺秀娟 叶研春 韩婷花 韩秀丽白秉元 马延梅,第一节 植物脱毒的原理,一 热处理脱毒 1.高温短时处理法 这种方法是利用病毒与植物耐热能力的不同，将木苗、接穗或种子等繁殖材料在一定的高温下处理一段时间，将其体内的病原杀死或钝化，失去侵染能力，而保持其本身的生活力，从而达到脱毒的目的。该法尤其适用于类菌原体、类细菌的脱毒，而对于类病毒的脱毒效果较差，因为类病毒通常有较强的热稳定性。这种处理方法与1921年首先用于甘蔗的脱毒，国内用这种方法处理柑橘，可脱除柑橘材料内的黄龙病类细菌。,2 低热长时处理法 低热长时处理一般不能使整株植株脱毒，而只能使个别器官脱毒，
2、大多是使在热处理过程中长出的茎尖无病毒。因此，处理的最后步骤是要取新产生的茎尖嫁接到无毒实生碊木上或将新产生的茎尖进行扦插繁殖，以获得脱病毒植株。但对不同病毒及不同植物种类的脱毒率差异很大。,二、组织培养脱毒 1.茎尖培养脱毒 Morel等（1952）首先从感染有花叶病毒的大丽花上分离出茎尖分生组织（0.25mm）培养得到植株，嫁接在大丽花实生砧木上检验未无病毒植株。从此，茎尖培养就成为脱去病毒的一个有效途径，并相继在马铃薯、菊花、兰花等茎尖培养脱毒的研究中获得成功。茎尖培养脱毒可脱除多种病毒、类病毒、类菌原体和类立克次体，很多不能通过热处理脱除的病毒可以通过茎尖培养而脱掉。茎尖培养脱毒直接从
3、茎尖生长获得植株，很少有变异，能很好地保持品种的特性。茎尖培养之所以能脱除病毒，是因为感染病毒的植株的幼嫩及未成熟的组织和器官中病毒含量较低，生长点（约0.11.5mm区域）则几乎不含病毒或含病毒很少。,植物茎尖等分生组织中不含或很少含有病毒的原因：（1）植物茎尖分生组织中胞间连丝发育不完全或太细，使病毒在细胞之间的扩散作用受到抑制。（2）病毒复制、运输速度与茎尖细胞生长速度不同，病毒向上运输速度慢，而而分生组织细胞繁殖快，结果使茎尖区域部分的细胞没有病毒。（3）植物生长点细胞中缺少病毒增值的感受点，因而复制过程不能进行。（4）茎尖等分生组织中存在抑制、钝化病毒的物质（5）茎尖或其他组织在培养
4、过程中病毒被钝化或抑制,2.茎尖微芽嫁接脱毒,茎尖微芽嫁接脱毒是组织培养与嫁接相结合，用以获得无病毒苗木的一种新技术。他将0.10.3mm的茎尖作为接穗，嫁接到由试管中培养出来的无毒实生砧木上，继而进行试管培养，愈合成为完整植株的脱毒方法。它可消除用热处理不能除去的一些病毒，如衰退病毒、木质陷孔病毒、黄脉病毒等。茎尖微芽嫁接脱毒可以解决一些果树茎尖培养成苗难，特别是生根困难的问题。有些果树种类或品种，如格瑞弗斯苹果通过茎尖组织培养，可以获得无病毒新梢，但不能生根，只有通过茎尖微芽嫁接脱毒才能获得完整植株。,3.其他外植体的组织培养方法脱毒,除茎尖培养外，还可从 花粉、花药、胚、胚珠及珠心等组织
5、培养获得无病毒的植株。这些器官或组织也是植株中含病毒较少的部位，但不同病毒或不同寄主植物使他们带毒或不带毒的情况各不相同，采用这些器官脱毒时，首先应弄清楚其带毒情况。关于一些植物种胚中不携带病毒的原因有两种观点：一种观点认为病毒不能进入胚中，植物子房中胚与其他母体细胞之间缺少维管束组织和胞间连丝的关系；另一种是认为病毒能进入胚，但进入后为寄主所消灭。有这样一种现象，种子在未成熟时带有病毒，到成熟时，病毒就消失了，这就说明，即使没有胞间连丝，病毒还可以通过其他途径进入胚中，但是有些植物的种子中存在着一种抑制病毒的物质。此外，还有人认为是有些种胚中缺少病毒增值所需要的重要物质。而使病毒不能复制,对
6、于一些果树植物要获得与亲本一致的无性系无病材料，可以从胚囊败育的子房中在胚囊败育之前获取胚珠或珠心组织进行培养。花药或花粉培养也可以作为一种脱毒方法，这种方法可结合单倍体育种进行，用花药培养进行草莓脱毒，脱毒率可达100%。花药培养获得的无毒材料多为高产优质的类型。植物的感染病组织中不是所有细胞都含有病毒。因此，也有人从感病植株分离原生质体、愈伤细胞或其他细胞，继而培养获得植株，然后通过鉴定病毒从中选择无病的材料,三、其他脱毒方法,1.合并使用热处理、茎尖培养或微芽嫁接脱毒 这种脱毒方法是从经热处理后的新梢顶端切取一段嫩梢，再嫁接到事先准备好的实生砧木上，如果用徒手嫁接，枝梢的长度至少要达到1
7、.01.5cm方可。若要使这样长的嫩梢无病毒，对于苹果至少须热处理34周，而一些耐热性弱的品种，在热处理期间，因高温伤害，大部分枯死，或嫁接后成活率很低。用茎尖培养脱毒，需要用很小的茎尖才能脱除病毒，通常采用的茎尖大小为0.10.2mm，因茎尖太小往往成活率很低。对于茎尖嫁接也有类似情况，茎尖太小往往不能成活。因此，茎尖培养、茎尖嫁接不仅很难操作，而且一些病毒不能脱去，如单纯的茎尖嫁接不能脱除柑橘碎叶病毒。合并使用热处理、茎尖培养或茎尖嫁接能克服两种方法各自的缺点。不仅可完全脱除病毒，同时茎尖成活率也得到提高，由此可大幅度延长热处理时间，增大用于培养的茎尖长度。目前国内外葡萄、苹果的脱毒多采用
8、热处理茎尖培养方法；柑橘则都采用热处理与茎尖嫁接相结合的办法。两种组合均提高了获得无病毒苗木的可能性,2.冷处理结合茎尖培养,有些作物对高温非常敏感，可用冷处理代替热处理并结合茎尖培养来脱毒。如三叶草的脱毒，将准备切去茎尖的母株在取茎尖之前，放在10中经过24个月，以代替热处理，可以部分去除病毒。这种方法也有人用于从马铃薯上消除梭状块茎类病毒。,3、化学处理结合茎尖培养,目前尚无一种抗病毒药剂能从整株植株消毒病毒，但某些病毒抑制 剂或钝化剂加到组织培养的培养基中却能消除培养组织中的病毒。Ribavirin（抗病毒醚）是一种对DNA病毒或RNA病毒具有广谱作用的人工合成物质。Hansen等将其喷
9、布在昆诺阿藜上，然后接种CLSV、SGV等种病毒，结果对CLSV的增值有很强的抑制效果，但对SGV、桃坏死环斑病毒、葡萄扇叶病毒、李矮化病毒无效。在一年生苹果生长期间，每隔7天喷布1次5*10-4抗病毒醚溶液，第二年春仍从苹果苗中检出了CLSV。若在培养基中加入抗病毒醚进行苹果茎尖培养，可脱除。山家弘土用含抗病毒醚、25.0的培养基培养用热处理、茎尖培养未能脱除SGV的试管苗茎尖，处理时间为、天。在各处理区增殖的新梢中任选一株，切取顶端部分长.，每隔天更换次新的培养基进行继代培养，最后继代到无药剂的培养基上培养，天后检测病毒。天处理的部分脱除了SGV，而、,天两个浓度的处理均全部脱除病毒，对照
10、则仍带毒。.对苹果茎尖有一定的要害，而.处理无明显药害。据分析，抗病毒醚不是直接作用于病毒，而是作用于寄主的代谢，从而阻止病毒的增殖，使新梢逐渐脱除病毒。因此，认为在果树植株生长期间定期喷布抗病毒醚，有可能在苗木顶端部分扩大无病毒区域，进而可增加茎尖培养的脱毒效率。除抗病毒醚以外，还有报道证明一些其他药剂也具有同样的作用。,4、合并使用药剂 合并使用化学药剂和热处理有助于提高热处理脱除病毒类病原的效果。,、培育株心苗,大多数植物病毒不通过种子传播，由此可通过培育株心来获得无病毒母株。例如大多数柑橘品种产生两种完全不同的胚，即合子胚和株心胚。合子胚由受精卵细胞发育而来，常称有性胚；株心胚由母本株
11、心体细胞发育而来，常称无性胚，株心胚在胚囊中发育，并与合子胚共存。由于株心胚是由母本体细胞发育而来，未经减数分裂，因此除个别体细胞突变外，株心胚长出的实生苗遗传上与母株完全相同。因此由株心胚获得的株心苗大多数病毒被脱除而遗传特征与母株完全相同。选择这种类型的株心苗，可应用标记花粉控制授粉，然后选出典型的实生苗。例如，枳的花粉可用作标记花粉，因为所有枳的杂种实生苗都具有三叶特征，很容易辨认和排除。培育株心系以获得无病毒苗有以下优点：（）可以肯定植株不带毒；（）花时间少：（）成本低：（）方法便于掌握：（）株心苗长势强。但株心系童期长，且易出现一些返祖性状。,第二节 植物脱毒操作技术,一、通过热处理
12、消除病毒的操作技术 再茎尖培养法建立以前，热疗法一直是从各种植物的受侵染的个体得到无病毒植株的有效方法。热处理可通过热水或热空气进行。热水处理对休眠芽效果较好，热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒，又能使寄主植物有较高的存活机会。热空气处理比较容易进行：把旺盛生长的植物移入到一个热疗室中，在3540下处理一定时间即可，处理时间的长短，可由几分钟到数周不等。然而，马铃薯病毒X（PVX）则要求在35下处理几个月才能得到一些无病毒茎尖，热处理之后要立即把茎尖切下来嫁接到无病毒的砧木上去。热处理时，最初几天空气温度应逐步增高，直至达到要求的温度为止。若钝化病毒所需的连续高温处理会伤害寄主组
13、织，则应当试验高低温交替的效果。在热处理期间应当保持适当的湿度和光照。根据Baker和Kinnaman（1973）的试验，在对香石竹进行脱毒热处理时，相对湿度必须保持在85%95%之间，准备接受热处理的植株必须具有丰富的碳水化合物储备。为达到这个目的，事先应对植物进行回缩。Holings(1965)报道，回缩能够增加植物忍受热处理的能力。,应用热疗法消除病毒的一个主要限制在于，并非所有的病毒都对热处理敏感，例如，在马铃薯应用这项技术只能消除卷叶病毒。一般来说，对于病毒等径的和线状的病毒，以及对于已知是由类菌原体引起的病害，热处理是有效的。延长寄主植物的热处理时间，也可能会钝化植物组织中的抗性因
14、子，因而和对照相比会降低处理效果。此外，在热处理之后只有一小部分植株能够存活。与单独采用热疗法相比，茎尖培养具有更广泛的适应性。很多不能由单独的热处理消除病毒，可以通过茎尖培养和热处理相结合，或单独的茎尖培养而将其消除。,二、通过茎尖培养消除病毒,1、茎尖培养术语 国内外用来描述茎尖培养这一技术的术语很多，在使用上也比较混乱，其中有尖芽培养、副芽培养、苗端培养、苗尖培养、分生组织培养、顶端培养等。但严格地讲，上述这些术语均不能确切地反映出用于组织培养的外植体的性质，因为仅仅依靠分生组织的生长锥、完整的顶芽或副芽，通常是不能培育出植株的。有人曾做过试验，从菊花上切取的1500个生长锥经培养，仅有
15、3个长成完整的植株，而作者认为这3个生长锥在切取时可能带有一枚叶原基而未被发现。多数试验表明，要想获得成功，外植体就必须包括分生组织的生长锥及1至数枚叶原基，因此建议使用一个折衷的词即茎尖（或顶端）分生组织培养。在应用组织培养方法以获得无病原菌植株时，所用的外植体可以是茎尖，也可以是茎的顶端分生组织。在这里，顶端分生组织是指最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约为100，最长长度为250.茎尖则是由顶端分生组织及下方的13个幼叶原基一起构成的。虽然通过顶端分生培养基消除病毒的机会较高，但在大多数研究中，无病毒植物都是通过培养1001000长的外植体得到的，即通过茎尖培养得到。,2、方法 进行脱毒
16、时，大小合乎脱毒需要的理想的外植体实际上是太小了，很难靠肉眼进行制备，因而需要一台带有适当光源的解剖镜（840*）。解剖时必须注意防止由于超净台的气流和解剖镜上碘钨灯散发的热而使茎尖变干，因此茎尖暴露的时间应当越短越好。使用冷光源灯（荧光灯）或玻璃纤维灯则更为理想，若在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行解剖，也有助于防止这类小外植体变干。与其他类型的组织培养一样，在进行茎尖培养时，首先的一步是获得表面不带病原菌的外植体。一般来说，茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，无须表面消毒就应当得到无菌的外植体。如有可能，应把供试植株种在无菌的盆土中，并放在温室中进行栽培。在浇水时，
17、水要直接浇在土壤上，而不要浇在叶片上。此外，还要给植株定期喷施内吸性杀菌剂。Wang和Hu（1980）所用的杀菌剂混合液含有杀真菌药剂苯菌灵（0.1%）和抗生素链霉素（0.1%）。使用这种杀菌剂混合液，对于田间种植的材料是格外重要的。对于某些田间植株上直接取来的枝条污染问题小得多。,尽管茎尖区域是高度无菌的，在切取外植体之前一般仍须对茎尖进行表面消毒。根据Wang和Hu（1980）的做法，叶片包被紧实的芽，如菊花、菠萝、姜和兰花等，只需在75%乙醇中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如蒜、麝香石竹和马铃薯等，则要用0.1%次氯酸钠溶液表面消毒10分钟。这些消毒方法在工作中应灵活运用，以便适应具体的
18、实验体系。在剖取茎尖时，要把茎芽置于解剖镜下，一只手用一把细镊子将其按住，另一只手用解剖针将叶原基剥掉。解剖针要常常蘸入90%乙醇，并用火焰灼烧以进行消毒。当形似一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用一个锋利的长柄刀片将分生组织切下来，上面可以带有叶原基，也可不带，然后再用同一工具将其接到培养基上。应特别注意的是，必须确保所切下来的茎尖外植体不与芽的较老部分或解剖镜台或持芽的镊子接触，尤其是当芽未曾进行过表面消毒时更需如此。,茎尖长出来的新茎，常常会在原来的培养基上生根，如若不能生根，则需另外采取措施。偶然情况下，在培养基中长出的茎无论经过怎样的处理都不生根，如Morel和Marti
19、n（1952）在大丽花中就遇到这种情况。在这种情况下，只有把脱毒的茎嫁接到健康的砧木上，就能得到完整的无毒植株。,3、在茎尖培养中影响脱毒效果的因素,培养基、外植体大小和培养条件等因子，会影响离体茎尖再生植株的能力。此外，在培养前或培养期间进行的热处理或化学处理，也会显著影响这一方法的效率。外植体的生理发育时期也与茎尖培养的脱毒效果有关。（1）培养基：通过正确选择培养基，可以显著提高获得完整植株的成功率。影响培养基主要性质的是其营养成分、生长调节物质和物理状态（液态、固态）。茎尖分生组织培养脱毒所需的培养基包括多种大量元素和微量元素，现在一般使用的是改进的MS培养基。裴荣倍对传统的培养基做了大
20、胆的改进，减少了微量元素及有机成分等十几种试剂，其繁殖的脱毒苗效果与MS完全培养基基本相同。简化培养基不仅降低了成本，而且节省了时间。,（2）外植体大小：在最适合的培养基条件下，外植体的大小可以决定茎尖的存活率。外植体越大，产生的再生植株的概率也就越高。在木薯中，只有200m长的外植体能够形成完整的植株，在小的茎尖或是形成愈伤组织，或是只能长根。小外植体对茎的生根也不太有利。当然，在考虑外植体的存活率时，应该与脱病毒联系起来。理想的外植体应小到足以能根除病毒，大到能发育成一个完整的植株。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力。大黄离体顶端分生组织必须带有23个叶原基
21、才能再生成完整植株。Shabde以及smith和Murashign在若干种植物中，虽然证实了不带叶原基的离体顶端分生组织有可能进行无限生长，并发育成完整的植株，但他们认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。在含有必要的生长调节物质的培养基中，离体顶端分生组织能在组织重建过程中迅速形成双极性轴。根的形成出现于叶原基分化之前，根的发育是轴向的，而不是纵向的。一旦根茎之间轴建立起来以后，进一步的发育将于种子苗发育的方式相同。虽然在理论上讲，不带叶原基的顶端分生组织是可能的外植体，但对于脱毒实践来说，并不可行。正如Murashign所说：如果培养基方法得当，用较大的茎尖做外植
22、体，其消除病毒的效果不一定比只用分生组织差。,(3)培养条件：在茎尖培养中，光照培养的效果通常都比暗培养好。Dale在一年生黑麦草中发现，光照度6000lx培养的茎尖有59%能再生植株，而暗培养的再生率只有34%。在马铃薯中茎尖培养的最适光照度是1000lx，4周后应增加到2000lx，当茎已长到1cm高时，光照度还应进一步增加到4000lx。在进行天竺葵茎尖培养的时候，需要有一个完全黑暗的时期，这可能有助于充分减少多酚物质的抑制作用。关于在离体茎尖培养中温度对植株再生的效应，截至目前还未见报道，培养通常都市在标准的培养室温度下进行。,（4）外植体的生理状态：茎尖最好从活跃生长的芽上切去。在麝
23、香石竹和菊花中，培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。但在草莓中没有看到这种差别。即使在腋芽比顶芽表现较差的情况下，为了增加脱毒植株的总数也还是要采用腋芽，这是因为液压数目比顶芽多。取牙的时间也是一个影响因子，这对于表现周期性生长习性的树木来说更是如此。在温带树种中，植物的生长只限于短暂的春季，此后很长的时间茎尖处于休眠状态，直到低温或光打破休眠为止。在这种情况下，茎尖培养应在春季进行，若要在休眠期进行，则必须采用某种适当的处理。据Boxus和quoirin报道，李属植物取芽之前必须把茎保存在4摄氏度下近6个月。茎尖培养的效率除取决于外植体的存活率和茎的发育程度外，还取决于茎的生根能力及其脱毒程序
24、。在麝香石竹中虽然冬季培养的茎尖马铃薯品种中，在春季和初夏采集的茎尖比在较晚季节采集的容易生根。,三、通过愈伤组织培养消除病毒,在由受感染的组织形成的愈伤组织中，并非所有的细胞都有该种病原菌。受TMV侵染的烟草愈伤组织，用机械方法将其分离成单个细胞后，只有40%带有这中病毒。由 受侵染的愈伤组织能再生出很多不含有TMV的植株，这一事实也证明了愈伤组织中的某些细胞实际上是不含病毒的。在许多其他植物的茎尖愈伤组织中也已经再生出无病毒植株。在受病毒全面侵染的愈伤组织中，某些细胞之所以不带有病毒，可能是由于:1、病毒的繁殖速度赶不上细胞的增值速度；2、有些细胞通过突变获得抗病毒的特性。抗病毒侵染的细胞
25、甚至可能与敏感型细胞存在与母体组织中,四、脱毒效果的检验,尽管我们在切取茎尖时十分小心，并且对他们进行了各种有利于消除病毒的处理，也只有一部分外植体能够产生无病毒植株。因此，对于每一个由茎尖或愈伤组织产生的植株，把他们用作母株以产生无病毒原种之前，必须针对特定的病毒进行检验。再通过培养产生的植物中，很多病毒具有一个滞后的复苏期。因此在头18个月必须对植株进行若干次检验。只有那些始终表现阴性结果的个体，才能说是已经通过了对某种或某些特定病毒的检验，可以在生产上推广使用。由于经过病毒检验的植株有可能重新感染，因而在繁殖过程的各个阶段还必须进行重复检验。确定在植物组织中是否有病毒存在最简单的方法，是
26、检验叶和茎是否有该种病毒所特有的可见症状。不过，由于可见症状可能要经过相当长的时间才能在寄主植物上表现出来，因此需要有更敏感的检验方法。植物的叶汁转染发是用于检验病毒的所有方法中最为敏感的方法。,进行病毒检验的接种方法具体如下：由受检植株上取下叶片，置于等容积的缓冲液中，用研钵和研杆将叶片研碎，在指示植物的叶片上撒上少许600目金刚砂，然后用受检植物的叶汁轻轻涂于其上。适当用力摩擦。以使指示植物叶表面受到侵染，但又不要损伤叶片。大约5分钟后，用水轻轻洗去叶片上的残余汁液。把接过种的指示植物 放在气闭温室或防蛀罩内，株间以及与其他植物间都要隔开一定距离。一般需要6-8天或几周，指示植物即可表现症
27、状。植物检验是否存在病毒的其他方法，还有血清测验法和电镜观察法。应用这两种方法能很快获得结果，但需要专门的技术和比较昂贵的设施。血清法和电镜法通常都要与汁液感染发同时使用，而不是完全取代汁液感染法。但对不表现可见症状的潜伏病毒来说，血清法和电镜法时必须的选择。,近几年来发展起来的PCR技术为快速可靠的检测病毒提供了行之有效的手段。对那些已知其核苷酸序列的病毒，可以人为的合成特异引物，通过多聚酶链式反应快速检测病毒存在与否。有关PCR的具体做法详见本书其他章节。但是，对那些尚未掌握其碱基序列的病毒还的采用前述的其他方法进行检测。五，无毒原种的保存与繁殖、利用 无毒植株并不具有额外的抗病性，他们有
28、可能很快又被重新感染。为了解决这个问题，应将无毒原种种在温室或防虫罩内灭过菌的土壤中。在大规模繁殖这些植物的时候，应把他们种在田间隔离区内，使植物在该区域很少或完全没有感染的机会。另外一种更容易也是更经济的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。,六、通过茎尖培养消除病毒的注意事项,要想得到和繁殖一个品种的脱毒植株，首先必须了解有关该种植株的一些背景知识，特别是可能周身侵染该种植物的病原菌以及这种植物的繁殖方法等。然后应当检查实验植物是否携带所疑有的病原菌，并确定茎尖外植体的适当大小，确定生长最快并能最大限度消除病毒的培养条件。最后要反复检查茎尖产生的植株是否还
29、带着疑有的病原，并在杜绝任何可能再侵染的条件下，繁殖那些确已脱毒的植株。,第三节 植物离体快速繁殖,一离体快速繁殖的概念与研究进展 离体快速繁殖是指在无菌条件下，利用植物体的一部分在人工控制的营养和环境条件下进行植物繁殖的一种方法，由于其繁殖速率快，称之为“快（速）繁（殖）”或“扩繁”，又由于其所用材料细小，称之为“微（型）繁（殖）”。实际上是一种特殊的营养繁殖方法，是植物扦插繁殖方法的扩展和延伸。所不同的是扦插繁殖系数低，只能得到1个从母体上发根的完整植株；而离体快繁只要建立起组织培养快速繁殖体系，材料将按几何级数增殖，增殖系数因植物种类有差异，多在5-10之间，而且由于组织培养环境几乎恒定
30、，因此可进行周年生产，一般1年内由6个左右的增殖周期。加之组织培养环境，养分等繁殖条件差异较小，苗木生长具有较好的一致性，繁殖苗木还具有较好的商品性。,植物快繁的器官形成方式,1、不定芽型2、器官型3、器官发生型4、类胚体发生型5、原球茎发生型,1、不定芽型,不定芽型：诱导顶端分生组织产生不定芽，再生成植株的方式特点：以芽繁芽，繁殖速度快：后代遗传性比较稳定,2、器官型,器官型：从器官外植体诱导不定芽，再生出植株的方式。特点：直接从器官上诱导不定芽，遗传性比较稳定，但繁殖速度慢,3、器官发生型,器官发生型：从器官外植体诱导愈伤组织，经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式。特点：繁殖速度快，由于经
31、过愈伤组织而再生成植株，遗传性不稳定,4、类胚体发生型,类胚体发生型：由植物细胞，组织或器官直接诱导发生胚状体结构，最终发育成苗的方式特点：遗传性稳定，但繁殖数量不如不定芽和器官发生型多。,5、原球茎型,原球茎型：种子消毒后，在培养基上播种，经一段时间培养而发生原球茎（带芽），然后由原球茎直接长成植株。兰属特有的器官发生方式。,兰花的萌发,兰花的启动,兰花的增殖,兰花的分化,培养的兰花,二、离体快速繁殖商业性生产的范围及应用,通过离体快速繁殖能生产种苗的植物种类很多，但大部分植物因一些关键技术尚未突破，繁殖系数较低、成本过高以及市场需求不大等而未能进行规模化和商业化生产。目前离体快速繁殖在生产
32、中的应用主要有以下几个方面：（1）用于稀缺或急需良种植物的繁殖。一些新选育或新引进的良种由于生产上需求的苗木多而急，用常规繁殖速度慢，短时间内无法满足，因此多尝试用离体快速繁殖方法来解决。这方面已有火炬松、香蕉、桉树、杨树、枣树、葡萄、山葡萄、杜鹃、樱桃、除虫菊、非洲菊、月季、苹果、甘蔗、马铃薯、枸杞、木薯、甘薯、香石竹、大丁草、苎麻及其他果树及砧木等植物的相关报道。我国采用离体快速繁殖技术解决生产问题取得了较大的成功。如广西建立了我国第一个年产甘蔗试管苗300万株的工厂，使原需要10年才能扩大繁殖用于生产的良种缩短为2年。,（2）用于茎尖脱毒及无病毒苗木试管快速繁殖。利用茎尖培养或热处理后再
33、培养，经检测无病毒后再用试管加快繁殖，可获得大量无病毒苗木。这是消除植物病毒病最有效的方法，也是试管繁殖用于生产最有成效的又一个方面。在国外，40%80%草莓是通过试管脱毒后繁殖的。我国每年生产各类脱毒试管苗达1000万株，经济和社会效益都十分显著。（3）用于自然界无法用种子繁殖或难以保持后代一致的三倍体、单倍体及基因工程植株的快速繁殖。如超雄性石刁柏是我试管繁殖。（4）濒临植物的拯救。一些珍稀植物或濒临、濒危灭绝植物，数量极少，若不加以保护及扩大繁殖，就有绝灭的可能。通过试管保存及扩大繁殖，则可以避免灭绝。例如，成都生物研究所成功地运用试管繁殖珍稀植物猀椤，现已在峨眉山建立起人工猀椤林；,（
34、5）用于种质的试管保存及交换。利用试管保存植物种质资源，具有体积小、保存数量多、条件可控制、避免病虫害再度污染、节省人力和土地以及便于国家和地区间的转移和交换等特点。近10多年来，该项技术有了长足的进步，可用低温和超低温方法保存种质。这是一条经济而有效的途径。特别是对于一些无性繁殖的植物和脱毒品种，市场一旦需要即可大量繁殖。德国许多植物组织培养室成为种质保存和繁育中心。国际马铃薯中心专门负责马铃薯种质的试管保持及国际交换。,三、离体快速繁殖体系的建立,1、无菌培养系的建立 任何植物细胞或组织培养体系的建立，都必须选用适宜的外植体。所谓外植体，就是第一次接种用的植物材料。虽然几乎任何植物组织或器
35、官均可作外植体，但具体采用何种组织或器官因培养体系的目的和接种的植物种类的不同而有所不同。通常木本植物、较大的草本植物以茎段比较适宜，能在培养基的诱导下萌发出侧芽，成为进一步繁殖的材料。一些草本植物比较容易繁殖，或本身短小或缺乏显著的茎，也可采用叶片、叶柄、花萼、花瓣等作为外植体。外植体选择好后，到田间或盆栽植物中选取洁净、无病虫害的植株，剪去比较幼嫩部分、生长能力较强的部位。样品采得后，保持其新鲜，迅速带回，在流水中冲洗12个小时，然后在超净操作台上用0.5%的升汞或其他表面消毒剂消毒，用无菌水冲洗34遍后，接种于灭菌的培养基上。如果外植体污染率小或没有污染，获得了无菌材料，并继代培养，能连
36、续生长繁殖下去，那么无菌培养系就已经建立。,2、诱导外植体生长与分化（1）顶芽和腋芽的发育：顶芽和腋芽在离体培养中都可被诱导而发育。单个芽可萌生出单一的小苗或多个小苗。在一些园艺品种中，有些独特的性状是由病毒硬气的引起的，这些病毒对寄主植物的健康并无强烈的影响，但如果采取茎尖培养就可能脱除病毒或减低其浓度，使具有观赏价值的性状丢失。,（2）不定芽的发育：这一植株再生方式由White于1943年在培养烟草愈伤组织时发现。不定芽的发生有一个从外植体上产生愈伤组织的阶段，这一阶段的长短和愈伤组织生长的 程度，在不同植物种类和培养条件而有极大地差异。有的愈伤组织生长极为旺盛，使外植体失去原有轮廓，以后
37、芽就从新形成的愈伤组织分化出来。而另一种情况，植物可能仅仅生长一点愈伤组织或几乎不生长愈伤组织，不定芽就从外植体表面受伤的或没有受伤的部位直接分化出来，如球根秋海棠、非洲紫罗兰、百合、等。从观赏园艺育苗的要求来说，应尽快出苗，减少愈伤组织发生，以免在长期的培养过程中细胞分裂不正常，失去观赏价值或失去再生成苗的能力等。植物的许多器官都可以作为诱导不定芽产生的外植体，如茎段、叶、叶柄、根、花茎、萼片、花瓣等。,（3）细胞胚胎状体的发生与发育：体细胞的发育途径类似，但不同于合子胚，它通过球形、心形、鱼雷形和子叶形的胚胎时期，最后发育成完整的小植株。通过体细胞胚状体的发生途径，进行无性系的大量繁殖具有
38、极大地潜力，其特点是：成苗数量多、速度快、结构完整。若干种高等植物的胚状体成苗途径已作了形态发生学上的证明，目前，包括裸子植、双子叶、单子叶植物中的许多科的代表植物，如五针松、苏铁、胡萝卜、金鱼草、山茶、百合、一品红、花叶芋等都有体细胞胚状体的发生。,（4）原球茎的发育：在兰科等植物的组织培养中，常从茎尖或侧芽的培养中产生一些原球茎，原球茎本身可以增殖，以后能萌发出小植株。原球茎最初是兰花的种子发芽过程中的一种形态学结构。种子萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，膨大的胚呈小圆锥状，称作原球茎。因此，原球茎可理解为缩短的，呈珠粒状的，由胚性细胞组成的类似嫩茎的器官。从顶芽和
39、侧芽的培养中产生的和种子萌发产生的都是这样的原球茎。从一个芽的周围能产生几个到几十个原球茎，培养一段时间以后，原球茎逐渐转绿，长出毛状假根，叶原基发育成幼叶，转移培养生根，形成完整的再生植株。,3.促进中间繁殖体的增殖,诱导外植体分化获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量还不多，也难以直接种植到栽培介质中去，这些培养材料可统称中间繁殖体，需要对其进一步培养增殖，才能发挥快速繁殖的优势。,4.壮苗与生根,材料增殖到一定数量后，就可使部分培养物进入壮苗与生根阶段。若不能及时培养物转移到生根培养基上，小苗就会老化，或因过分拥挤而使无效苗增多。生根壮苗培养基多采用1/2或1/4的MS培养基，添加适量的生
40、长素，一般24周即可生根。,5.试管苗移栽与管护,试管中小苗经过几个阶段的培养，小苗已生根成为完整的再生植株，或虽未生根但已粗壮，适宜无根扦插时，便可进行移栽。由于出瓶后试管苗生长的环境与初始生长环境相差很大，在试管苗移栽的初始阶段一定要做好养护管理工作，如保持小苗的水分供需平衡、选择适当的种植介质、防止菌类滋生、调整好光、温条件等，以提高试管苗的移栽成活率。,四、植物离体快繁的常见问题,1、污染2、遗传稳定性3、试管苗玻璃化现象4、外植体褐变的发生,真菌污染的特点：培养基上长霉，一般接种3-5天就可见，霉的颜色有黑、白、黄等。细菌污染的特点：在培养材料的附近出现粘液状菌斑，一般接种1-2天就
41、可发现。,细菌污染,表现：发酵状、水渍状、滴性云雾状。污染原因：培养基灭菌不过关 接种器具污染 操作污染 交叉污染,真菌污染,表现：灰、白、黄、绿菌丝体、孢子组成绒毛状物有色圈污染原因：培养室湿度过大 瓶口积落有灰尘和孢子,材料内部带菌,在培养基中表现得症状：外植体接触培养基部位长菌 外植体损伤部位长菌 外植体生长不良或表现出缺绿,1、接种室的灭菌,接种室的地面、墙壁要擦洗干净接种前一夜用甲醛熏蒸10ml/m2接种室还可以采用紫外灯灭菌,2、超净工作台的灭菌,开风机前将紫外灯打开30分钟以上之后开风机15分钟用95%酒精洗工作台面,3、接种器皿、用具的灭菌,用具先用95%酒精侵泡，后于酒精灯外焰灼烧,4、工作人员接种前应做的准备工作,个人卫生，穿工作服用75%酒精擦手,防止空气污染,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶口倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,防止操作带来的污染,接种过程中尽可能达到悬空要求,防止操作带来的污染,瓶盖朝上放，接种完毕后立即改好瓶盖,谢谢！,
