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1、牛奶中蛋白质的提取与鉴定,内蒙古农业大学生物化学与分子生物学实验教学中心,制作人：王瑞刚,实验原理实验试剂实验步骤,实验原理,牛乳和羊乳中含丰富的蛋白质，其中主要是酪蛋白。酪蛋白在羊乳中约占总蛋白量的3/4，牛乳中约占总蛋白 量的5/6。酪蛋白是一种含磷蛋白的不均一混合物。蛋白 质在其等电点pH溶液中溶解度降低。根据这个原理，将牛 乳的pH调整至4.8，即酪蛋白的等电点时，酪蛋白即沉淀 出来。用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪，得到纯 的酪蛋白。所得酪蛋白供定性鉴定。除去酪蛋白的滤液中，尚含有球蛋白、清蛋白等多种 蛋白质。,实验试剂,1醋酸钠缓冲液(0.2mol/LpH4.6)2米伦(Mil
2、lon)试剂 将汞100g溶于140ml(密度1.42)的浓 硝酸中(在通风橱内进行)。然后加两倍量的蒸馏水稀释。3 95%乙醇。4乙醚。5 10%NaCl 6 0.5%Na2C03。7 0.lmol/LNaOH。8 0.2%HCl 9饱和氢氧化钙(Ca(OH)2)。10 5%醋酸铅。,实验步骤,(一)酪蛋白的制备 取新鲜牛乳30ml，放人100ml烧杯中加热至40。加入 30ml加热至同样温度的醋酸缓冲液，一边加一边摇动，并 用pH计检测，调整混合液的pH为4.8（实际中准确加入牛奶 与醋酸缓冲液体积相同时，可以不用调节pH）。冷却至室 温，继续放置5分钟，然后将溶液转入离心管中离心 300
3、0r/min，时间5分钟（注意离心时要对角配平），离心 后上清液保留做鉴定实验。所得沉淀物悬浮在约30ml等量的 醇醚混合液中，搅匀，离心3000r/min，时间5分钟，弃清 液，所得沉淀摊在表面皿上，使醇醚混合液挥发。称其干重 计算其产量。,（二）酪蛋白的性质鉴定 1溶解度：取试管6支，分别加入水、10%氯化钠、0.5%碳酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、0.2%盐酸及饱和氢氧化 钙溶液各2ml。于每管中加入少量酪蛋白。不断摇荡，观 察记录各管中的酪蛋白溶解度。2米伦反应 取酪蛋白少许，放置于试管中。加入lml蒸 馏水，再加入米伦试剂10滴，振摇，并徐徐加热。观察其 颜色变化。3含硫(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)测定:取少量酪蛋 白溶于lmlO.1 mol/L氢氧化钠溶液中，再加入1-3滴5%醋酸 铅，加热煮沸，溶液变为黑色。（三）乳清中可凝固性蛋白质的鉴定 将制备酪蛋白时所得的清液移入烧杯中，徐徐加热。即出现蛋白质沉淀。此为乳清中的球蛋白和清蛋白。,
