《双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与.ppt（16页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、双脱氧末端终止法 测序的原理,主讲：氧气yun,FrederickSanger,双脱氧末端终止法,DNA聚合酶不能从头合成子链,如果dNTP的3碳上没有羟基,ddNTP双脱氧核苷酸,基本原理：,DNA复制,ddNTP的结构,聚丙烯酰胺凝胶电泳,DNA复制的特点,酶：DNA聚合酶,模板：单链DNA,底物：dNTP,引物：需要,引物的作用：提供3羟基末端,ddNTP的特点,DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP。,ddNTP 3位不是-OH，但5磷酸基团正常。,ddNTP参入到寡核苷酸链的3末端后，DNA链的延长会被迫停止。,聚丙烯酰胺凝胶电泳特点,精度相当高！能分离长度达300-500个碱基
2、，而差别仅一个碱基的同系单链核苷酸序列。,操作步骤,1制备单链模板与引物退火,2链延伸-终止反应,3.聚丙烯酰胺凝胶电泳,4.放射自显影,5.阅读测序结果,制备单链模板与引物退火,双链DNA,单链DNA,单链DNA,加入引物，加热，退火,带引物的模板单链DNA,链延伸-终止反应,带引物的模板单链DNA,核素标记的dNTP,分成四管,双脱氧鸟苷,双脱氧腺苷,双脱氧胸苷,双脱氧胞苷,37下反应5min后加入EDTA使DNA聚合酶失活,含有各种长度DNA分子的溶液,EDTA 乙二胺四乙酸，一种二价金属离子螯合剂，DNA聚合酶对Mg2+浓度十分敏感。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,含有各种长度DNA分子的溶液,95加热 变性,冰上冷却,点样开始电泳,电泳完成，得到凝胶,放射自显影,电泳完成，得到凝胶,固定凝胶,真空抽干,放入X射线片夹,得到X射线片,与照相机原理相似，利用射线使胶片感光，然后通过显影过程把“像”显示出来。,阅读测序结果,一般是从下往上阅读X射线片上的显影区带，即从测序引物的5端读向3端。,Thank you!,
