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1、项目类别申报学科代码项目编号AC030504湖南省自然科学基金申 请 书 ( 表 一 )项目名称： NGU泌尿生殖道hBD-2基因表达、诱导及丹参酮对其的影响申 请 者：所在单位： 湖南中医学院邮政编码：410007通讯地址： 长沙市韶山中路119号Email：电 话： 传 真：申请日期： 2003年5月8日湖南省自然科学基金委员会二三年制项目类别申报学科代码项目编号AC030504湖南省自然科学基金申 请 书 ( 表 二 )项目名称： NGU泌尿生殖道hBD-2基因表达、诱导及丹参酮对其的影响 湖南省自然科学基金委员会二 O O 三年制注意：湖南省自然科学基金申请书（表二）所填写全部内容不得
2、出现申请者及项目组成员的姓名和工作单位，否则，将视为形式审查不合格。项 目 研 究 内 容 和 意 义 简 介（限400字）运用免疫学和分子生物学技术研究hBD-2基因在泌尿生殖道粘膜上皮的表达，hBD-2肽在非淋（支原体）感染中的作用和对支原体的杀灭活性与作用机制 ，以及丹参酮对hBD-2基因表达的影响。从而为非淋开创新的治疗方法提供基础，以更有效的治疗非淋球菌性尿道炎（宫颈炎）；并研究中医药对细胞基因及蛋白产物表达水平的调节作用，从较深层次探讨中医药作用机理。 一、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处，可加附页）对基础研究，着重结合学科发展趋势，论述项
3、目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。(可加附页)人体防御素1、2是近年来发现的一类小分子内源性抗微生物多肽，可分为和防御素，不同的防御素各有其抗病原微生物的特点；而人体防御素-2（hBD-2）发现有广谱高效抗G、G菌、真菌、某些衣壳病毒、支原体的活性，且未见有耐药性。其作用机制主要是通过干扰和破坏微生物胞膜而起抑制或杀伤作用；是天然免疫的重要介质，并与获得性免疫有较密切关系3。防御素在泌尿生殖系统的研究成果，为治疗生殖系统的疑难病、多发病提供了全新的思路和手段。但目前学者多倾向于研究防御素在不同部位的表达及影响因素4。应用研究
4、，尤其是应用天然药物诱导其表达，暂未见报导。现已证实5内分泌(如雌激素)和前炎症因子可调控HD-5（一种防御素）在阴道、子宫颈、子宫、输卵管的表达；最近又发现防御素（HNP1-3）在患有感染性盆腔疾病（PID，由淋球菌、阴道毛滴虫、沙眼衣原体引起）妇女的表达水平较无PID妇女中度升高，且强度与子宫内膜炎病情密切相关6。但对防御素，特别是对可诱导表达的人体防御素-2（hBD-2）是否亦有类似作用有待进一步实验证实。非淋菌性尿道炎（宫颈炎）为当前最为常见的性传播疾病之一，主要由衣原体和支原体引起，可致不育、不孕，给患者造成极大的痛苦。在西方国家，居性传播疾病的首位，我国2000年为253116例，
5、占性病首位7。目前对非淋菌性尿道炎（宫颈炎）的治疗仍以西药抗生素（如注射用阿奇霉素8、克拉霉素、罗红霉素、氧氟沙星）为主，有一定疗效，但却有一定的副作用。注射用阿奇霉素可引起腹痛、恶心、呕吐、眩晕，注射部位红肿热痛等副作用；氧氟沙星有肝肾损害，对中枢神经系统及罹患孕妇胎儿的骨发育都产生不良影响；红霉素也存在胃肠道反应，使患者难以耐受。不规则治疗，反复感染和慢性迁延等因素，使得耐药菌株日益增多，交叉耐药和多种耐药明显增多9，有研究表明10支原体阳性者94.8%发生耐药，耐1种和2种药物分别占27.7%，31.6%。对红霉素耐药占86.5%。给临床治疗带来了极大困难。祖国医学认为“正气存内，邪不可
6、干”；将抗御外邪入侵的正气称为“卫气”。素问：“卫者，水谷之悍气也，其气忄票 疾滑利，不能入于脉内，故循皮肤之中，分肉之间，熏于肓膜，散于胸腹，逆其气则病，从其气则愈”。说明卫气是防御功能的主要成分，不仅能在体表起着屏障作用，亦可在机体内部与病邪斗争，发挥免疫作用。防御素生物学特点及分布规律与其有相似之处，值得注意的是：没有肺部感染征象的系统感染，支气管分泌物中hBD-2亦有升高11，而在抗生素治疗后hBD-2有戏剧性下降，与肺主气似有一定联系12，为我们从中医正气入手研究防御素治疗非淋菌性尿道炎（宫颈炎）提供了可贵的思路。非淋菌性尿道炎（宫颈炎）多缠绵难愈，结合病征，临床实践，与其本“久病多
7、虚，久病多瘀”有关。“气为血帅，血为气母”，血虚则无以载气，气亦随之而少；血瘀不去而新血不生，则又致血虚。气主固护肌表，防御外邪的入侵，气虚则外邪易于侵袭，不能鼓邪外出，病则迁延难愈。“一味丹参，功同四物”，丹参既可活血祛瘀，又可补血资气。丹参酮13是从中药丹参中提取的脂溶性有效成分，主要成分是隐丹参酮，具有明确的抗菌、消炎和微弱的雌性激素样活性，临床应用较广。皮肤病、妇科、心血管内科、抗肿瘤方面都取得了较好的疗效。研究证实14：丹参酮对TNF-、白细胞介素、上皮细胞的分化、抑癌基因P53都可产生调节作用15，而TNF-、白细胞介素16、雌激素5俱可使hBD-2表达增强。本项目组前期研究发现，
8、hBD-2在支原体感染的人体泌尿生殖道粘膜上皮有高表达，并且支原体可以诱导大鼠rBD-2（与hBD-2有高度同源性）的表达（详细内容见研究基础）。结合防御素在泌尿生殖系统的研究现状，人体防御素-2（hBD-2）已证实的抗微生物活性，非淋菌性尿道炎（宫颈炎）的病机特点，丹参传统功效与现代研究成果，从分子生物学角度研究人体防御素-2(hBD-2)在非淋菌性尿道炎（宫颈炎）发病过程中的表达情况，为非淋菌性尿道炎（宫颈炎）开创新的治疗思路提供基础，以寻找更广谱有效而无耐药性的新一代抗微生物药物，以替代抗生素和解决严重的耐药性难题；研究在丹参酮参与下，人体泌尿生殖道粘膜上皮hBD-2的表达量及其mRNA
9、水平的变化；以期通过天然药物调节机体自身正气，激发天然免疫和获得性免疫，为防御素的临床应用做出初步尝试；运用分子生物学研究中医药的“邪正学说”和卫气理论；研究中医药对细胞基因及蛋白产物表达水平的调节作用，可从较深层次探讨中医药作用机理。参考文献：1、 Vicki Kaiser and Gill Diamond Expression of mammalian defensin genes J Journal of Leukocyte Biology. 2000;68:779-784.2、 Schroder, J. M. Epithelial antimicrobial peptides: inn
10、ate local host response elements J Cell. Mol. Life Sci. 1999; 56, 32-463、 Yang, D., Chertov, O., Bykovskaia, S. N., et al B-Defensins: Linking Innate and Adaptive Immunity Through Dendritic and T Cell CCR6 J Science 1999. (286): 525-528 4、 Com E, Bourgeon F, Evrard B,et al Expression of antimicrobia
11、l defensins in the male reproductive tract of rats, mice, and humans.J Biol Reprod. 2003 Jan;68(1):95-104.5、 Quayle AJ, Porter EM,et al.Gene expression, immunolocalization, and secretion of human defensin-5 in human female reproductive tract.J Am J Pathol. 1998 May;152(5):1247-58.6、 Wiesenfeld HC, H
12、eine RP,. Association between elevated neutrophil defensin levels and endometritis J Infect Dis. 2002 Sep 15;186(6):792-7.7、 吴志华.皮肤性病学M.广州.广东科技出版社,2003,157-160.8、 黄怀球赖维.注射用阿奇霉素治疗非淋菌性尿道炎和宫颈炎随机对照多中心临床研究J.中国抗生素杂志.2002.27（4）：237-239.9、 涂亚庭.林能兴.许长征等,解脲支原体对10种抗生素体外敏感性研究J.岭南皮肤性病学杂志 2001.3(9):137-13810、杨文林、
13、侯捷、刘丹蓉等,523例泌尿生殖道感染者支原体培养及药敏分析J.中国皮肤性病杂志.1998 12(3)：93.11、Schibli DJ, Hunter HN, The solution structures of the human beta-defensins lead to a better understanding of the potent bactericidal activity of HBD3 against Staphylococcus aureus J. Biol Chem. 2002;277(10):8279-89.12、 Y Hamanaka, M Nakashima
14、,A Wada et al .Expression of human B defensin2 in Helicobacter pylori induced gastritis:antibacterial effect of hBD-2 against Helicobacter pylori J Gut .2001Oct.49:481-487.13、 石乃玉.黄海金.丹参酮药理及临床应用J.中国医师杂志.2001. 3(2):150-151.14、 李洪清.徐学明.丹参对慢性肾功能不全患者的白细胞介素-6和肿瘤坏死因子的影响J.临床内科杂志.2002.19(6):470-471.15、 何金涛.
15、周清华.袁淑兰等.丹参酮对人肺癌细胞株的增殖抑制作用及其分子机理J. 中国肺癌杂志.2002.4.2(5):123-125.16、 Schaller-Bals S, Schulze A, Am Increased levels of antimicrobial peptides in tracheal aspirates of newborn infants during infection J. Respir Crit Care Med. 2002;165(7):992-5. 二、研究方案1 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题(可加附页)研究目标：a. 探索hBD-2基因在泌尿生殖道粘膜上
16、皮的表达。b探索hBD-2肽在支原体感染中的干预作用及对支原体的杀灭活性与作用机制。 c探索临床上应用丹参酮对hBD-2基因表达的影响及hBD-2与中医卫气的关系。研究内容：a 正常个体，支原体感染及用丹参酮治疗后的NGU患者的泌尿生殖道粘膜中hBD-2 mRNA和hBD-2肽的表达水平（定性与定量）b支原体、IL-4、IL-13、IL-8、丹参酮对培养的泌尿生殖道粘膜上皮角质形成细胞hBD-2基因表达的影响。c泌尿生殖道粘膜中hBD-2 mRNA的RT-PCR合成扩增cDNA。d体外hBD-2基因克隆与重组。e重组hBD-2肽杀灭支原体的活性及作用机制。f丹参酮对hBD-2基因表达的作用及机
17、制。拟解决的关键问题：a体外克隆的DNA的测序与鉴定。 2本项目的特色与创新之处a. 国内外首次研究非淋（支原体）感染的炎症性生殖道粘膜中hBD-2基因表达水平。b. 国内外首次研究支原体、IL-4、IL-13、IL-8对泌尿生殖道粘膜上皮中hBD-2基因表达的诱导。c. 体外hBD-2 mRNA逆转录及hBD-2 cDNA的合成扩增，d. 体外hBD-2基因克隆与重组。e. 国内外首次研究hBD-2肽杀灭支原体的活性与作用机制。f. 国内外首次研究丹参酮对泌尿生殖道粘膜上皮中hBD-2基因表达的影响及防御素与中医卫气的关系。3拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析（可加附页）研究方
18、法（1）用免疫组化染色分析hBD-2肽在泌尿生殖道粘膜上皮中的分布。（2）用Western Blot技术对hBD-2肽的表达水平进行定量分析。（3）用RT-PCR反应从hBD-2 mRNA合成扩增cDNA进行测序与鉴定。（4）用重组质粒法进行hBD-2基因的克隆与重组。(5). 用CCU法进行hBD-2肽的杀灭支原体活性分析。技术路线 泌尿生殖道粘膜标本 目的： 测hBD-2 mRNA 目的： 测hBD-2肽 正常角质形成 患 者 正常者,患者治疗前， 患者治疗前， 细胞培养 患者治疗后 治疗后 支原体 治 治 匀 提 IL-4 疗 疗 切 浆 取 IL-13 前 后 后 蛋 IL-8 片 白
19、 丹参酮 质 刺激 提取总RNA 兔抗hBD-2抗体(第一抗体) SDS聚丙烯酰胺凝胶 immlbilon.PSQ膜上电泳 逆转录PCR合成扩增cDNA 羊抗兔IgG（第二抗体） 兔抗hBD-2抗体印迹 PCR 产物纯化 Avidin +HRPO混合物孵化 膜用AKP缀合羊抗兔抗体孵化 重组质粒, 琼脂糖凝胶 氨基乙咔唑染色 在AKP显影液中显影植入感受态细菌 电泳观察 苏木精复染 PCR产物 免疫组 化研究 信号强度与标准物DNA鉴定与定量 直接测序及定量 免疫染色观察 比较进行定量实验方案（1）实验对象:纳入标准: 非淋患者: 18-40岁,无其它疾病. 8人，4男4女.半月内未用任何抗生
20、素治疗. 正常志愿者:18-40岁,4人,未服药物.排除标准: 孕妇,产妇,月经期,绝经后,40或18岁,患有其它重要疾病. 其中分未治疗和治疗后两组:未治疗指未用丹参酮治疗过,治疗后指用丹参酮2粒口服,日三次,共一个月.两组均检查其切片的免疫组化、Western blot和PCR分析.（2）组织标本取样: 泌尿生殖道内窥镜配合活检,取直径6mm样本从炎症或正常粘膜,立即在-70oC 冰冻,三分之一作免疫组化分析,三分之一作hBD-2肽的测量,三分之一作hBD-2 mRNA检测.（3）组织细胞培养: 健康组织标本从活检获得用作角质形成细胞培养.组织用Dulbeccos PBS(含青霉素200I
21、U/ml, 链霉素200ug/ml,两性霉素B 5ug/ml,庆大霉素0.1ug/ml)冲洗.为了从下层结缔组织分离上皮,标本在Dispase II(2.4U/ml)5oC过夜孵化.然后上皮从下层结缔组织机械分离,上皮层置于0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA小心吸移产生细胞悬液.然后,用含10%胎牛血清的基质中和胰蛋白酶,悬液离心(208Xg )5分钟.小丸悬浮于基质,接种到含饲养层(含有丝裂霉素处理的NIH3T3小鼠成纤维细胞)的T-25组织培养盒中.细胞在基质中培养,基质组成:3份Dulbeccos modified Eagles 基质,1份Hams F12基质含10%胎牛血清.基质用青
22、霉素100IU/ml,链霉素100ug/ml,两性霉素2.5ug/ml,表皮生长因子(EGF)10ng/ml,霍乱毒素0.1nm,氢可400ng/ml补充.每2-3天更换1次,培养皿保持在37oC,含5%CO2潮湿环境中. 当培养达到75-80%的铺满数时,用0.5mM EDTA37oC处理5分钟除去饲养层.培养物暴露到胰蛋白酶-EDTA 在37oC 1-2分钟,粘连的角质形成细胞在37oC胰蛋白酶-EDTA孵化4-5分钟或直到显微镜观察证实大多数细胞已分开.在胰蛋白酶失活下,用血细胞计数器确定角质细胞计数,然后细胞接种于组织培养基.细胞的角质形成细胞性质用免疫组化证实为高分子量(50,56.
23、5,57,58,66和66kDa)细胞角蛋白或用组织学超微结构特征.（4）切片中的hBD-2肽用免疫组化染色:凝固的5um 粘膜组织切片用丙酮固定10分钟,在10%羊非免疫血清中孵化10分钟.移去封阻血清,切片用(1:1000)的抗hBD-2兔多克隆抗体染色,在稀释的1:50(v/v)PBS冲洗2次,再用生物素酰基化羊抗兔第二抗体室温下孵化30分钟,用PBS冲洗三次,再在室温下用抗生物素蛋白(avidin)和生物素酰基化辣根过氧化酶混合物孵化(1:1)附加的30分钟.然后用氨基乙咔唑单溶液染色10分钟,用苏木精反染.阴性对照用非免疫同型抗体和抗hBD-2抗体预孵化,用合成肽确保抗hBD-2抗体
24、的特异结合.所有玻片加密观察染色的强度.免疫染色的强度用显微镜分为0-3级,0为无染色,3为最强染色.（5）标本中hBD-2肽用Western Blot法定量分析: 活检标本称重,用匀浆器在1ml 1M HCL和1%三氟醋酸冰液中匀浆10分钟.匀浆组织溶液在4oC旋转过夜,在4oC 14000rpm离心20分钟后,上清转入新试管,低压冻干.最后的蛋白小丸用蒸馏水溶解,使最后蛋白浓度为每毫升0.1mg组织.测量:15ul再低压冻干,在十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液中4oC重悬浮过夜.样本与已知数量的hBD-2(作为标准物)煮沸5分钟,加到16.5%SDS-tricine聚丙烯酰胺凝胶上,样本置于
25、immlbilon-PSQ膜上,在0.18mA,0.05M硼酸液,PH9.0,再加入20%甲醇和0.05%SDS液中电泳1小时.在TRIS缓冲液(500uM NaCl+20uMTRIS,PH7.5)中用0.5%戊二醛固定30分钟,在0.75%Blotto去脂干奶粉PBS(0.9%NaCl+10mM PBS,PH7.4)封阻30分钟,然后在1:500的兔抗hBD-2血清的抗体稀释缓冲液(0.25% Blotto的PBS,含0.01%硫柳汞作为防腐剂)孵化18小时进行印迹.再用0.1%牛血清白蛋白在Blotto TRIS缓冲液(0.9%NaCl+20mM TRIS-Cl,PH4.5-5.0)冲洗3
26、次,每次10分钟.膜在1:2000 AKP缀合羊抗兔IgG抗体稀释缓冲液中孵化1小时印迹,然后如前洗3次,再在AKP显影液中显影.为了定量hBD-2肽,组织提取物的信号强度直接与已知数量的合成肽的同步预备标准物进行比较.原活检样本的肽浓度用活检标本的抗菌肽的实验确定的数量除以上皮体积来计算.（6）hBD-2 mRNA的RT-PCR分析.总RNA从活检标本中分离,用TRI试剂盒按操作指南提取.紫外分光光度法鉴定其纯度,甲醛变性电泳测定其完整性. 根据GeneBank中提供的hBD-2基因顺序，用斯坦福大学在线引物设计软件Web Primer设计两个引物,前引物为5atgagggtcttgtatc
27、tcc-3,反引物:5tcatggctttttgcagcatt-3.扩增反应用微量管,在25ul混合物,含有8%甘油,1Taq Man缓冲液A(含500mM KCl,100mM TRIS-Cl.0.1M EDTA,PH8.3 室温下),300uM 每个dATP,dGTP,dCTP,dUTP;5.5uM MgCl;900nM前引物;900nM反引物;0.625U的Ampli Taq Gold DNA多聚酶;6.25U的Moloney小鼠白血病逆转录酶;10U的RNA酶抑制剂和RNA模板.RT-PCR扩增,在48oC30分钟,然后用Taq Gold在95oC预变性10分钟,进行25,35个循环,9
28、5oC 15秒,60oC 1分钟.最后在70oC 延时5分钟.扩增后产物用PCR纯化试剂盒纯化后(1).经琼脂糖凝胶电泳检查,与预计扩增片段大小比较.(2)直接进行鉴定与测序.(3)用于重组质粒克隆与鉴定.（7）hBD-2 cDNA的重组质粒,克隆,测序与鉴定. PCR产物纯化后,用T4-DNA连接酶将纯化的hBD-2 cDNA片段与pGEM-T easy载体连接,连接反应产物转化宿主JM109感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素,X-gal和异丙基硫代B-D半乳糖苷(IPIG)的LB选择平板.从转化平板挑取白色单菌落,用质粒提取试剂盒提取质粒,并用以下方法鉴定重组质粒(1)用限制性内切酶EcoR
29、I对质粒DNA作酶切分析;(2)以重组质粒DNA为模板,用引物P1和P2作PCR产物分析;(3)质粒DNA插入片段之序列测定及鉴定.（8）hBD-2 mRNA的诱导及支原体感染分析.5105细胞/ml在对照基质、50ng/ml IL-4、50ng/ml IL-13或两者联合、20ng/ml IL-8、丹参酮(100ng/ml)孵化24小时.细胞冲洗1次,然后用TRI试剂匀浆(重复移液管).总RNA按操作指南分离提取后进行RT-PCR反应。细胞在1108支原体/井培养1小时,支原体冲洗后除去,50ug/ml罗红霉素加入杀来残留的细胞外支原体.上清和细胞在附加的5-6小时后孵化后收集.细胞用作RN
30、A提取,上清收藏在80oC作hBD-2肽的定量。.（9）hBD-2肽杀灭支原体活性分析有活性的重组hBD-2肽,其抗支原体活性用CCU进行分析.从病人分离的支原体制成一定浓度的液体培养基,加入不同浓度的hBD-2肽(10-5,10-6,10-7,10-8,10-9g/ml),最后测定每井中支原体数目.杀灭百分数: (1肽孵化后CCU/对照支原体CCU)100.支原体培养基:需胆固醇,PH5.5-6.5,95%N2和5%CO2环境,37oC孵育1-2天.CCU计算:能看到有颜色变化的最高稀释倍数定为含有一个颜色单位CCU.颜色变化为橘黄色变成粉红色.可行性分析 我院为一所教学、科研一体的高等医学
31、院校，具备较高的科研实力。研究项目具体承担单位系国家中医药管理局“全国 医疗中心”、“国家 重点专科”、湖南省“重点建设学科”单位。现有博导1名，硕导2名，在读硕士、博士14名。配备有省某局验收合格的“二级科研实验室”。先后取得多项科研成果，论著颇丰，具备较高科研实力。 本项目所需仪器设备已基本具备，关键技术开展也已成熟，前期预试验以成功完成，一些关键研究方法也已取得成功经验，与预期结果相一致。4年度研究计划及预期进展 2004.1-2004.3 调研、实验室检测技术的完善。 2004.4-2004.12 标本hBD-2肽的免疫组化、Western Blotting分析及hBD-2 mRNA的
32、PCR分析。 2005.1-2005.7 hBD-2基因的重组质粒、克隆、测序与鉴定。2005.8-2006.3 组织细胞培养及hBD-2 mRNA的诱导及支原体感染分析。 2006.4-2006.7 hBD-2肽杀灭支原体活性分析。 2006.8-2006.12 资料整理，统计学处理，撰写论文，申请鉴定。5预期研究成果(能否形成自有知识产权成果)（1）研究成果达国内领先水平；（2）阐明hBD-2基因在泌尿生殖道粘膜上皮的表达；（3）阐明hBD-2肽在非淋（支原体）感染中的干预作用及对支原体的杀灭活性与作用机制；（4）阐明丹参酮对hBD-2基因表达的影响；（5）在国内外一级学术期刊发表论文5篇。三、经费预算支 出 科 目金 额（万元）计 算 依 据 及 理 由1科研业务费0.3文献检索、论文发表及参加学术交流费用2. 实验材料费3.00菌株、试剂3. 仪器设备费0.3配套小型设备及软件更新4. 实验室改装费0.1完善实验室条件5. 协作费0.2所涉及的试验技术协作6. 组织实施费0.1交通、管理等杂费 合计 4.0 注：预算支出科目参见国家自然科学基金项目资助经费管理办法第二章：预算管理。 12
