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1、单克隆抗体,温故知新：,1.细胞工程的两大类型？各自的技术手段及其原理是？,2.核移植的两大类型？其中提供细胞质的为去核的卵母细胞，为什么选去核的卵母细胞？,3.动物细胞融合的实质，原理和方法？融合后的细胞叫？,体积大，易操作；含有使细胞核的全能性容易表达的物质和营养条件,植物细胞工程：植物组织培养（细胞的全能性）植物体细胞杂交（细胞的全能性、细胞膜的流动性）动物细胞工程：动物细胞培养（细胞增殖）核移植（动物细胞核的全能性）动物细胞融合（细胞膜的流动性）单克隆抗体（细胞膜的流动性、细胞增殖）,传统的抗体生产方法及缺陷,1.传统的生产方法:向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血
2、清中分离所需要的抗体。2.缺陷：产量低、纯度低，而且制备的抗体特异性差。,主要分布血清，还有的分布在组织液，外分泌液,单克隆抗体,1.概念：由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单克隆抗体。2.特点：特异性强、灵敏度高,一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖,杂交瘤细胞,动物细胞培养技术,动物细胞融合,单克隆抗体,既能在体外大量繁殖，又能产生特异性抗体,单克隆抗体,浆细胞,第一次筛选用特定的选择培养基帅选出杂交瘤细胞,融合,细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞
3、中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？,小资料：,在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！,3种杂交细胞：B-B融合细胞、杂交瘤细胞 瘤-瘤融合细胞未融合的细胞：单个的B细胞、单个的骨髓瘤细胞,这五种细胞中，没有分裂能力，逐渐衰老死亡；的DNA复制只有D途径，加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡，但的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断，但是还可以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。,通常采用有限稀释法，将筛选出来的杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板
4、上培养，使每孔细胞不多于一个，再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。,再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞,阳性孔,方法抗原-抗体杂交法,用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。抗原抗体杂交法检测呈阳性反应,如何得到大量的单克隆抗体？,单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。,单克隆抗体,杂交细胞,杂交瘤细胞,骨髓瘤细胞,特异性杂交瘤细胞,杂交瘤细胞系,提取,经过免疫的B淋巴细胞,动物细胞融合技术,动物细胞培养技术,单克隆抗体的制备过程：,特点：既能
5、大量繁殖又能产生专一抗体,特点：特异性强灵敏度高可大量制备,特定的选择培养基,多孔细胞培养板,高考热点：,1.此过程中的B淋巴细胞是经过免疫的，实际上就是浆细胞。2.融合后形成的杂交细胞有多种，考虑两两融合，共有三种：B-B、B-瘤(杂交瘤细胞)、瘤-瘤 3.单克隆抗体制备中用到的技术手段：动物细胞融合、动物细胞培养。4.原理：细胞膜的流动性、细胞增殖,5.整个制备过程为何要经过两次筛选?,第一次筛选用特定的选择培养基，筛选出杂交瘤细胞（多种）第二次用多孔培养板，筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。,单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。,科勒,米尔斯坦,荣
6、获1984年诺贝尔生理学或医学奖,4、单抗隆抗体的应用,作为诊断试剂,定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病,用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、特异性强，具有准确、高效、简易、快速的优点。,用于治疗疾病和运载药物,利用同位素标记单抗，在特定组织成像,制成生物导弹，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。,“生物导弹”单克隆抗体药物 导向 杀死癌细胞,单克隆抗体的制备,1、怎样获得能分泌专一抗体的B淋巴细胞？2、从何处获得较多的B淋巴细胞？3、用什么方法可以使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？4、怎样筛选出杂交瘤细胞？5、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？6、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？7、怎样获得大量的单一抗体？,反复注射特定的抗原，免疫小鼠。,小鼠的脾脏,PEG、灭活的病毒等,利用HAT选择培养基培养，筛选,否,用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。抗原抗体杂交法检测呈阳性反应,体内或体外大量培养特异的杂交瘤细胞，从中提取单一抗体。,
