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1、哈尔滨医科大学药学院生物制药教研室,第六章 酶工程制药,第五节 酶工程的研究现状,一、酶基因工程生产酶,二、突变酶,三、进化酶,四、抗体酶,人工模拟酶指根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。,肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽,半合成酶以天然酶为母体，用化学方法或基因工程方法引进适当的活性部位或催化基团，从而形成一种新的人工酶,*印记酶*分子印迹是指制备对某一特定化合物具有选择性的聚合物的过程，这种特定化合物叫印迹分子或模
2、板分子。以一种分子充当模板，周围用聚合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。,分子印迹的*原理 当模板分子与带有官能团的单体分子接触时，会尽可能同单体官能团形成多重作用点，待聚合后，这种作用就会被固定下来，当模板分子被除去后，聚合物中就形成了与模板分子在空间上互补的具有多重作用位点的结合部位，这样的结合部位对模板分子可产生多重相互作用，因而对此模板分子具有特异性结合能力。,过程：A.印迹分子与功能单体互补，形成印迹分子-功能单体复合物；B.用胶联剂在印迹分子-功能单体复合物周围发生聚合反应，形成交联的复合物；C.从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子具有选择性的聚合物
3、。,制备选择性聚合物的过程(a)在印迹分子和交联剂存在下通过光和热启动集合作用(b)形成聚合物(c)研磨聚合物(d)抽提印迹分子(e)得到选择性聚合物MIPM-单体;CR-交联剂;P-印迹分子,印迹分子与单体相互作用的类型共价分子印迹非共价分子印迹,分子印记酶分子印迹酶的设计所选择的印迹分子主要有底物、底物类似物、酶抑制剂、过渡态类似物和产物等,生物印迹酶生物印迹是分子印迹的一种形式，它是以天然的生物材料为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。,五、酶的化学修饰,酶在实际应用中有局限性：作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解；酶蛋白经不起温度、酸碱、
4、有机溶剂及时间的考验，半衰期短、易变性失活；酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求，限制了酶制剂的应用范围。,1.酶化学修饰的概念：在较温和的条件下，以可控制的方式使一种酶同某些化学试剂起特异性的反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变,一、酶化学修饰,2.酶化学修饰的目的：a.提高生物活性,胰蛋白酶,b.增强在不良环境中的稳定性c.针对异体反应，降低生物识别能力,二、化学修饰的方法,化学修饰方法的几个问题对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条件及侧链基团性质等；选择修饰剂考虑：1）分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性；2）修饰剂上反应基团的数目及位置；3
5、）修饰剂上反应基团的活化方法和条件（一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团）；选择酶反应条件要注意：1）反应体系的溶剂性质、盐浓度、PH、温度、时间；2）酶与修饰剂的比例。,最常用的修饰剂PEG类修饰,聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)通常没有免疫原性和毒性,不会破坏生物分子的活性，其生物相容性已通过美国食品和药物管理局(FDA)认证。,酶蛋白侧链基团的常用修饰,赖氨酸氨基的烷基化（卤代乙酸等）；具有两个临位羰基的化合物修饰精氨酸胍基（丁二酮等）；烷基化试剂修饰巯基；碘代乙酸修饰组氨酸咪唑基；还有色氨酸吲哆基、甲硫氨酸甲硫基、酚基、脂肪族
6、羟基等；,二硫键的化学修饰,氨基的化学修饰,羧基的化学修饰,应用较多的修饰方法,1.酶的表面化学修饰(1)大分子修饰：可溶性大分子，其中相对分子量在500-20000范围内的PEG类修饰剂应用最广，既能溶于水，又溶于大多数的有机溶剂，化学修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇（MPEG),(2)小分子修饰：利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。已经被广泛应用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖，乙酸酐，硬脂酸，邻苯二酸酐等。(3)交联修饰：使用双功能基团试剂如戊二醛，PEG等将酶蛋白分子之间，亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联，可使酶分子活性结构加固，并可
7、提高其稳定性，增加了酶在非水溶液中的使用价值。(4)固定化修饰：通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上后，由于酶所处的微环境的改变，会使酶的性质（最适ph，最适温度，稳定性等）改变。,2.酶分子内部修饰3.结合定点突变的化学修饰,1.热稳定性提高2.抗各类失活因子能力提高3.抗原性消除4.体内半衰期延长5.最适pH改变6.酶学性质变化7.对组织分布能力改变,三、修饰酶的特性,四、酶化学修饰的应用,酶经过化学修饰后会产生的变化：1.提高生物活性；2.增强在不良环境中的稳定性；3.针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性；4.产生新的催化能力；,在医药方面：克服酶在体内的不稳定性
8、 消除或降低酶的抗原性有助于酶分子到达并集中于病灶细胞在酶结构功能研究中：研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；确定氨基酸残基的功能；测定酶分子中某种氨基酸的数量在工业领域：化学修饰酶能够提高酶对热、酸、碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适ph等酶学性质。,酶蛋白化学修饰的局限性,1.专一性是相对的2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变3.只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行4.因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。,第六节 酶工程在制药工业中的应用,31,32,固定化酶产品介绍,氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶，可以用于生产各种L-氨基
9、酸药物。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。,33,固定化酶法生产L-氨基酸,乙酰-DLAla LAla+乙酰-DAla,Aminoacylase氨基酰化酶,34,储罐,反应产物,消旋反应器,固定化酶柱子DEAE-葡聚糖氨基酰化酶,晶体 L-Ala,L-Ala A-D-Ala,A-L-Ala A-D-Ala,35,(2)天门
10、冬氨酸酶：1973年日本用聚丙烯酰胺凝胶为载体，将具有高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化天门冬氨酸酶，用于工业化生产，将延胡索酸转化生产L-天门冬氨酸。1978年以后，改用角叉菜胶为载体制备固定化酶，也可将天门冬氨酸酶从大肠杆菌细胞中提取分离出来，再用离子键结合法制成固定化酶，用于工业化生产。,36,(3)天门冬氨酸脱羧酶：将含天门冬氨酸脱羧酶的假单胞菌菌体，用凝胶包埋法制成固定化天门冬氨酸脱羧酶，于1982年用于工业化生产，催化L-天门冬氨酸脱去羧基，生产L-丙氨酸。,37,(4)青霉素酰化酶：是在药物生产中广泛应用的一种固定化酶。可用多种方法固定化。1973年已用于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素。用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pH等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6一氨基青霉烷酸(6一APA)或7一氨基头孢霉烷酸(7一ACA)，也可以催化6一APA或7一ACA与其他的羧酸衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团的青霉素或头孢霉素。,38,固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸,青霉素酰化酶与抗生素改造,39,40,41,E.Coli 斜面 细胞 固定化细胞 青霉素G 转化液 滤液 6-APA 粗品,培养,固定,转化,过滤,抽提,1.技术路线,42,青霉素酰化酶转化流程图,思考题,1.核酶？2.抗体酶及其制备方法？,
