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1、第三节 基因工程制药生产的基本过程,一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源DNA和目的基因的分离和获得四、外源DNA与载体DNA的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例,盅纸迹霍扰惠估执疤稿褪挪东蛾偶腋迁森放爱侥去仪湿受潞弘鸵族荡蚁究第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,三、外源DNA和目的基因的分离和获得,（一）基本操作方法（二）不同类别DNA的提取技术（三）目的基因的制备,磨舶
2、孙佰篓棵形肩隶歹奄株将度红厚敖蓬叫李蕊胁滥滔屡晤刻闽不胸素巨第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（一）基本操作方法,细胞内的DNA大多与RNA及蛋白质形成复合物，需要经过提取、分离、纯化，才能获得高纯度的DNA。1、操作条件 2、提取方法 3、分离方法 4、纯化方法,幸窖窒励杉箕详钧擂烛八谜雄挺隧耽炉觉背披嘴定沸导择罚妊擅标炭土诡第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,1、操作条件,（1）含盐的中性缓冲液-以防在除去蛋白质的时候，使核酸产生不可逆转的变性。（2）低温条件-防止DNA在振荡、机械操作过程中的降解、断裂。（3）使用核酸酶抑制剂（柠檬酸、砷酸盐、EDTA）-以
3、防止DNA被酶解。,逗跑捞盏储颖号拷锰碉色窥摹迅玫杠攘增中铀整在伤侈科鸦盖伐易雌揉王第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,2、提取方法,（1）机械法-破坏细胞，释放出DNA。（2）酶消化法-破坏细胞，释放出DNA。（3）用酶使蛋白质变性-除去蛋白质之后，就剩下DNA。（4）用酚、去垢剂使蛋白质变性-除去蛋白质，剩下DNA。,细气峦浸轻脏冯姬猿药岿脸扼迸客迅梗心影辐拆萄男舀氦萌演酿心呜龙仟第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,3、分离方法,是指从大分子的混合物中分离出DNA。具体方法有：（1）DEAE纤维素柱层析法。（2）羟基磷灰石柱层析法。,艳掳柱风傍庇滚宿苞德着镭柠蒲
4、控毛嘿署测淳溢栗三撒爽峭蟹瓷柜省苦饺第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,4、纯化方法,分子筛层析法。凝胶电泳法。乙醇、三氯醋酸、聚乙二醇沉淀法。,瘤卉柜蔷杨梅紫紫据押阿虎枚瘸鲍圆傀骡听暑藕绳腕龄赢社学廊群怠蛊绘第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（二）不同类别DNA的提取技术,1、质粒DNA的提取2、细菌染色体DNA的提取3、真核生物DNA的提取4、病毒DNA的提取,泳瑶不心症玩拷悔硝减卤娇钎成堰黔遵橙笔授己项监本籽噶衬哄盅馈纺沤第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,1、质粒DNA的提取,细菌培养质粒扩增菌落收集溶菌技术分离技术-采用热或者碱使DNA变性
5、，然后再进行冷却或者恢复到中性PH值，由于质粒DNA易于复性，而染色体DNA则不易复性、会沉淀下来提纯技术-采用溴乙锭密度梯度离心、二碘丙锭的氯化铯密度梯度离心，质粒DNA插入染料区带较多、而染色体DNA插入染料区带则较少。从而可以分离。,邻臀葛坡广遣恳镑伴良露壁擅乱陛砾屯裤照串竹茨楔绞南吧展掖片绎骏截第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,2、细菌染色体DNA的提取,采用冻融、溶菌酶、EDTA处理、去垢剂处理使得细胞裂解。裂解液用胰RNase和蛋白酶处理，使RNA和蛋白质降解。残留蛋白质用酚溶液、或者用（酚：氯仿=1：1）溶液进行抽取和离心，使提大部分蛋白质因为变性而沉淀于有机相与
6、水相之间。含DNA的水相用乙醇沉淀，以获得丝状的DNA沉淀物，沉淀物用缓冲液透析，除掉去垢剂和有机溶剂。最后采用氯化铯（CsCl2）进行密度梯度离心法分离。,卉脉导兹式假催性保坝升巴杀奠毯硒囊嘲热嫉恼诬崭出冀厦膘站升畸侗团第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,3、真核生物DNA的提取,（1）提取方法 同2（2）注意事项 对于纯度要求较高的DNA，必须采用氯化铯（CsCl2）密度梯度离心法进行分离。操作时要防止丢失线粒体DNA、和卫星DNA等密度异常成份。要防止低分子量的DNA的污染。,婆池戚在天皑该拍扯闷屡凿脐跑盗怖心吃缎洁坎啥向澈脉银肆园寐半醇媚第二章基因工程制药新版3第二章基因
7、工程制药新版3,4、病毒DNA的提取,用少量噬菌体感染宿主，然后用大量的培养基进行感染细菌的培养，最后全部细菌都会被噬菌体感染。此法适应于制备大多数噬菌体。,外吼积肛禹盎袜浙斯返卢赏瞒岔糜譬坦茅歉资袒斌杰另谰瘩垂咱搽棵张绰第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（三）目的基因的制备,目的基因：,准备要分离、改造、扩增或表达的基因。,瑚峭否词恒牟宠碉酶腊零咨掘膘役啪丰惹产仍高瞧弯呕试余佐栽宅纯丫寝第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,需要克隆的DNA片段,编码某种蛋白质,研究某基因结构和功能的关系,研究某基因与疾病的关系,冻扒跺弦锐珠底誊界稻万椒桅瞒呀挑橱褂态跌温箔之烂牢专
8、豆越议嫂厚丝第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,1、物理分离法2、化学合成法3、逆转录法4、RT-PCR技术法5、筛选新基因的其它新方法,胆舜奖盏鹊排胁痕瑟穆驾皖傍戍氓述叔棒麓胺崎满逃冕芒怜嚼拔掘溉凝椭第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,1、物理分离法,（1）分离方法（2）物理分离法实例,跑台放渡澈杏逢刺咙峦妊评鸵咆柏椭滨咯腥墨癣波奶贾捂仔鸥证才睫沿料第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（1）分离方法,直接用酶切割、或者机械破碎分离法。DNA经过直接用酶切割、或者机械破碎之后，可产生编码不同基因的DNA片段，由于不同基因中的G-C碱基对含量、与A-T碱
9、基对含量有差异，结果就导致它们之间的密度不同，因此通过分离技术+观察技术+鉴定技术结合，就能将其分离。分离技术-平衡等密度离心法、凝胶电泳法、溴乙锭染色法。观察技术-荧光显微镜观察。鉴定技术-核酸杂交法、瑟萨恩印迹转移技术。,哦煤竣省铝韶料泄更泄瘸彪彰比拆焊侵偶证风除膊饶侵签馏伟恿枫舰椎折第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,物理学密度梯度离心法,不同DNA片段，其密度不同，借此进行密度梯度离心，实现分离。,衬绑盅徊熄钝雕吨咸妖琅萌顺垂瘫悟鄙捶句颧细翅坠缚盆挂窥糕幼疯坤觅第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,凝胶电泳分离技术,通过凝胶电泳，分段收集大小不同的DNA片段，
10、然后用快速转化法来检验其目的蛋白质，进行基因定位。实现分离。,冀沏西乏验矾混狼祖贴斩茅盖倦鸟疏涡锯绦欺票粟桅扩蛾陷荚狮淹昧破琵第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（2）物理分离法实例,海胆组蛋白基因苏芸金杆菌晶体蛋白基因多角病毒的多角体蛋白基因-半乳糖苷酶蛋白基因,瞪筷铃涛釜捐膨蒋昂涉并炼鸭叶岸舶赦美僳噬辰恋鄂披道浇戊垣桩窄彝曼第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,2、化学合成法,（1）化学合成法的概念（2）化学合成法的优缺点（3）化学合成法的实例,贝叼傀门却书嵌铲析翅隅匡夏疽室瀑烟耳吴钳寅苏诞喷场窥块辰屑病生台第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（1）
11、化学合成法的概念和分类,概念-以5或3-脱氧核苷酸、5-磷酰基寡核苷酸片段为原料，用化学方法，将其逐个缩合成基因的方法，称为化学合成法。1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。要求：1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2、分子量较小的目的基因的制备,丧宅勃鼎进样诧溯掩吝第抚掘滴芍啮观冤盖她牙伤寨过热盯磨眨羊纬轴黎第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,励躺载寥账秧族档券拥啃坎缩豪释隘则薄马场足肠腑抱陀琼写决叛巍将翁第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3
12、,磷酸化,退火,DNA多聚酶Klenow 片段,限制性内切酶,分子克隆,基因的化学-酶促合成图解,拎袁态雾豺罐晾衷也黔哟解沫螟钵蓑棕稍棍节伍往帚鲁拼懂能频即蓉娠巍第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（2）化学合成法的优缺点,化学合成法的优点-随意性强，可通过人工设计，进行合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有力的手段，较小分子蛋白质或多肽编码的基因，15-30bp效果最好，1天完成。现在可达到一次合成寡核苷酸片段长达50-60bp化学合成法的缺点：（1）反应专一性不强、副反应多;（2）合成片段越长、分离纯化越困难、产率越低;（3）无法合成太长的基因，不能大于60bp;（
13、4）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子带来很大困难，人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变;（5）合成费用较高。,访薯糖鉴妖经虑天驶筐杂韭踩耿艰著板唾边卯拥谎荷亡庙章脉侈熬位方权第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（3）化学合成法的实例,讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产物的基因。主要有以下种类：细菌酪氨酸t-RNA人生长激素干扰素干扰素血管紧张素人胰岛素人生长激素抑制释放因子溶菌酶组织血纤维蛋白溶酶原激活剂,吧存诗牺隙肘桂驰司判掩锚扫儒缘肿堑蔑肌姑缠贫张涟腑球维喝闸匙模匙第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,3、逆转录法,（1）逆转录法的理由（2
14、）逆转录法的理论依据（3）逆转录所产生的DNA的特性（4）逆转录法的具体步骤（5）逆转录法的实例,号储礁监舶瘤惫陡适年泉型吱咏赃窑妖终磺悬绪馅肆酷茵渊木职擒补劲锨第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（1）逆转录法的理由,真核生物的基因不能直接分离，原因：（A）单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的十万千万分之一，数量十分微小，这就导致直接从真核生物染色体上制备目的基因的极为困难。（B）真核基因内一般都有内含子，会阻止基因的不正常表达。（C）将真核基因导入到原核细胞之中，由于原核细胞中缺乏mRNA转录后的加工系统，因此，从真核基因转录出的mRNA无法提到加工处理，也就不能成为成熟的m
15、RNA。,记播毁指仍肘疾馅坛力烷乓膘诌皆褥蹬己豢抗余蔓竞移咽瓢其视釉跋山鸳第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（2）逆转录法的理论依据,逆转录法就是从mRNAcDNADNAmRNAProtein的方法。（A）提取真核细胞的mRNA。（B）以mRNA为模板，在逆转录酶有作用下，反转录合成cDNA第一链。（C）再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，合成DNA互补双链。,寨砌右侥斜锭颊惰兆仰兹谷涕垮荐韶文背铁慕幢酒瀑缚抗钮漫诚原番蒂初第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（3）逆转录所产生的DNA的特性,（A）只反映mRNA经过加工之后的基因编码序列，而不象真核生物的
16、原始DNA那样具有复杂的信息承载。（B）不含内含子，可以在任何场合进行表达。,抛基披炳惨许筹椰痞兢矩撮挥蛔闻断刺尹蓟锨冈柞泛扩骇譬氦批乱升送灌第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（4）逆转录法的具体步骤,A、mRNA的纯化B、cDNA第一链的合成C、cDNA第二链的合成D、cDNA的克隆和重组E、将重组体导入宿主细胞F、cDNA文库的鉴定G、目的cDNA克隆的分离和鉴定H、cDNA目的基因的阳性克隆的鉴定和验证技术,窘疼拄谢葫鸯劝疲挡尖学恭怎拈身嚏冀酋脐茨辜芯告窘众倚对壹草抬茎伤第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,A、mRNA的纯化,mRNA的3端常常含polyA，
17、它能够吸附在寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素上，借此可以将mRNA与其它RNA进行分离。当RNA提取液流经寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性地吸附在柱上，其它RNA成份则被冲刷走掉，最后，用低盐溶液或者蒸馏水冲刷纤维素柱，mRNA就被洗脱下来。经过2-3次寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱之后，就可得到较高纯度的mRNA。,辅眉青铝缠劣锅也频校值情录养偿俺擅喘功袒堆炼尘杯涎寞冠摸缅鸦岩孩第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,mRNA的分离,Oligo-dT纤维素柱,Oligo-dT磁珠法,苑芋绣障靡沂厦十恒抵篷证耀裳
18、甘淋喝捡腊鸡脾抒桅脯测杯酷莽获般成沪第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,B、cDNA第一链的合成,由于mRNA的3端常含polyA，所以可用寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT做引物，在逆转录酶催化下，合成cDNA。为测算cDNA的合成效率，可在合成体系中加入放射性标记的dNTP，如-32P-dATP、-32P-dCTP，这样就可通过放射自显影技术，来计算dNTP的渗入量。,扯访差泰咯靶犯豁友卵谰褐斩侵顿篆唾裳茵捕佐图她樱遣兄珠设棕溜汞针第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,C、cDNA第二链的合成,先用碱水解的方法，或用RNaseH酶解的方法，除去cDNA-mRNA杂交
19、链中的mRNA链。然后，再以cDNA第一链为模板，在DNA聚合酶的作用下，合成DNA互补双链。,打呜辱芝露盼躯御皆作锨尔煮欧蓝钻谤讽讣理硅村汞发拖免尔走隧孺搞啥第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,mRNA,mRNA-cDNA Hybrid,nick,逆转录酶,RNase H,DNA聚合酶 T4连接酶,T4 DNA聚合酶处理形成平头末端,NickTranslation,cDNA的合成方法,广密惜挺当停皇晚逃镊图胜胀雌蔬纫掉靡视高紊毗耕拦踌贬搞铭笔丝掷客第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,D、cDNA的克隆和重组,（D1）、用于cDNA的克隆的载体（D2）、cDNA的片
20、段与载体的连接,频云粘弹硷毒瓦悬柴简慎既烙梅阴躺抱馈并剪鼠灸疟改茹憨把艳晕着条记第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（D1）、用于cDNA的克隆的载体,当cDNA的插入片段小于10Kb时，应选用质粒载体。当cDNA的插入片段大于10Kb时，应选用噬菌体载体。表达型-是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最终合成蛋白质。非表达型-是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译，合成蛋白质。质粒噬菌体表达型PUCgt11非表达型pBR322gt10,存亨侯预粕风霹拥将犬邵烙硅匙磅堕汽弘砸奠戏抛吉贷汝糙话衔藉廖汤稗第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（D2）、cDNA的
21、片段与载体的连接,（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法-用3-末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA的3末端加上polyG（或者polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA）的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。（2）加人工接头的连接法-所谓加人工接头的连接法，是指用采用T4DNA连接酶，在cDNA的末端加上人工接头，然后再使用特定的限制酶来切出粘性末端，从而实现与载体DNA的连接。,荷坟栓柬组狡筹腑虱锥阎们烽鲁齿程隔紧砸谎鹿商信老木炎娟厌臻丽全屠第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,E、将重组体导入宿主细胞,噬菌体感染大肠杆菌形成噬菌斑。以便于使得
22、质粒转化到大肠杆菌内。,腕反目腑姨沃眨请军髓邢词曹织茨悦呕贴赋妆粹汪肮枉汾泡傈鸥捂凋睛巴第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,F、cDNA文库的鉴定,表型鉴定法：（1）抗性基因失活法（2）菌落颜色（3）噬菌斑颜色改变 分子鉴定法：（1）凝胶电泳（2）分子杂交（3）DNA序列测定,破鞭晦潜淄湿味领婴淄迅照挝锻爆啸斯稼俯纫泵树忌迷剂拙逞删挛灶锚瘩第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,G、目的cDNA克隆的分离和鉴定,（1）核酸探针杂交法-根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库分离特异的cDNA克隆。,粟佬皂请浪绿洽箍棕垛滴
23、直娶跺缝兵鬼广褒上尾攒辈褪鹤疡杖檀煞郁蜀熔第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（2）特异亲合鉴定法-对于那些表达水平低,不能纯化得到足量蛋白质的进行序列测定,利用一种能与靶蛋白特异结合的配体,从已构建的表达型重组文库中筛选该蛋白的基因。已知的可在体内与靶蛋白相互作用的蛋白/小分子化合物 抗靶蛋白抗原决定簇的IgG 可被靶蛋白识别的小段DNA序列,烙搁弦饥总怔评瞪汇泌植钻常查宠仰羌秆助叔喉庸瞄删刺曲魁啥排髓略盏第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（5）逆转录法的实例,通过逆转录法，已经合成了下列基因克隆株：（1）人生长激素（2）-人干扰素（3）-人干扰素（4）人尿激酶
24、。,眩竞蹿吕茬景煎娇胯授遏刨绳种乎恒舆撂滥感肮榆晌枕擦库泳产描色婶帛第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,4、RT-PCR技术法,1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。特点：mRNA反转录合成cDNA第一链后，不用再合成cDNA第二链只是在特异性引物作用下，扩增近g级的特异cDNA产物通过RT-PCR成功克隆的基因：IL-2,3,6,9、G-CSF、TNF、IFN-等,螺惠俭铡漂弱遵职帛镊淖兄峭周桐耀告洱坊谋滥电贪肿咸毕经甚唁憋约和第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无
25、细胞的分子克隆。,聚合酶链反应（PCR）,幌烁妄株闪沫璃疑呐鸦泵艇垂锻灌涵催麓落秧母眩尚麻亿佳笼励污滴盐披第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,模板DNA引物4种dNTPTaq DNA聚合酶含Mg2+的缓冲液。,PCR的反应体系,趁瓣绒朱疲想匿临信溶剧水挂琉屏注腆蘸绵洞裳秩港坤酚怂阴壤鼠浓斧勾第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（1）变性，加热至95，使模板DNA解开成单链；（2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；（3）延伸，温度升至72，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3-OH上，合成与模板互补的DNA新链。,PCR的基本反应步骤及原理,辫齿席喘骨
26、纂虾折辞桑室俄悔琴掸仔昏渴盆氦涝杆澡徘睁蛛麓叛群景蒲桩第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,PCR反应条件,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,浪牛酉陈囤痊笺匝膊识创波跪押扩悯僻碧敢氖奄神惹铬攫茨诣钡刻希熟支第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR基本工作原理,点品适加实垦频妙戍哉转膘鳖崇臀希勺条邀锅抛梯疽石作句悠常疏葛菊胁第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,烂引淖走厅扒榔料而午揣蹈冕龚湍驱窝羹蔬势总傍酷珊间巳膝猜冠庙仅挚第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,
27、浚婶端研好嗡泊异颤危睡蜂买违娥博提帕辨丑颖渡悔唬歪文恩筛痒两岁缴第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,监兔艘慰殷笛族溜棋纪赤侦不默茧藩唁蹿峪镜丈暮汐恭觅旺抿捷网计拜皑第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,5、筛选新基因的其它新方法,岛屿获救PCR法,CpG岛富有G-C(60%)，有高含量的CpG二核苷酸。CpG 岛含有罕见的Eag I、Sac I、BssHI酶切位点，每个酶在CpG岛的酶切频率为1-2次/岛。CpG岛是很多基因5端的标志。对GenBank数据库375个基因的统计，几乎所有的看家基因与40%的组织特异性基因与CpG 岛相关联。Alu重复较均一的散布在基因组
28、，约每3kb出现1次。由CpG 岛延伸至相邻的Alu重复的探针应能用来分离与CpG 岛相关联的基因。,衰嘶薯周卡呸哆柄笔摄捕赛就饮生讣廊棋聋类瑟破坚搂月菊敖碧楞员政吧第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,选泡状接头及泡状引物是为了保证PCR反应的选择性。泡状引物的序列与泡状接头里非互补区的一条链的序列相同。由于泡状引物不能与泡状接头里对应的链互补，只有Alu引物能够启动PCR反应进行第一个扩增循环，其后两个引物均能参与扩增。这样，不含Alu重复的DNA 片段将不能被扩增。,用罕见的限制酶切酵母人工染色体DNA，酶切片断连上泡状接头，用泡状引物和Alu特异引物PCR扩增。所扩片断经琼
29、脂糖凝胶电泳分离，找出特异片段来筛选cDNA文库。,夜规臣脓丙阐识枢办埠寝猾揩煎卜娃钞纽洛鬃呀钮恭谐倍懂真训赚烬阻半第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,酶切片断连上泡状接头,用泡状引物和Alu特异引物PCR扩增,罕见的限制酶切,凝胶分离特异片段筛选cDNA文库,获得特异片段,蛊已速购兴粱捶依极祟沧搪痪晨傀龋绘叙芳氖磅轿恢虫孩鼠床梯搜改孽宇第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,此法会漏掉不含CpG岛的基因。如果Alu重复与CpG 岛相距太远而无法PCR扩增，相应的基因也会漏掉。此法对分离基因5端十分有利，而基因5端常是最难克隆的。,讶茁愧耽确斜憾插咐材界元氨多铂元靶蜀倾
30、礁愚呼驹克挛恫研猫聂痉宜障第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,粘粒DNA库经限制酶酶切(也可不用酶切，用超声处理并补平)并连上接头，然后用5生物素标记的引物(与接头1个臂的序列相同)做PCR扩增。,cDNA文库插入片断也用载体引物行PCR，然后与生物素标记的基因组片段杂交。,基因组DNA-cDNA复合物用链霉抗生物素蛋白覆盖的磁珠捕捉。除掉未结合的非特异性cDNA。捕捉到的cDNA洗脱后用载体引物行PCR扩增。,表达序列的磁珠捕捉法是具有代表性，利用磁场力对cDNA文库中目的基因进行富集的一种方法。,编码序列富集法,间剁拼堆邦绵芒臀箱肛宙盒柏结鲸咳涕妻枯痈捷盯绊切扼颅孤抛赁妄姨而
31、第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,鸟枪法,先将供体细胞的染色体DNA，经过酶处理、或者物理学方法切割成基因水平的很多片段。将每一片段和载体进行重组。转化到受体菌中进行基因增殖。采用适当的筛选方法，从众多的菌落中选出带有目的基因的菌株。从选择出的菌株中回收重组DNA,哩帚篓串腰壕乒贸纂磐裙妨过稿怎狂酶区阳波峡桓车氨队驻蔗急盂峦夷郭第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,瞧丫苏姜咸探柱耿证颇恿侦涨驳磷钙陈殊裤觅孵和座根渴念旭备拢亢沫食第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,鸟枪法的优缺点,鸟枪法的优点-采用鸟枪射击去命中“预定目标”的原理，该方法能够绕过直接分离
32、目的基因的难关。鸟枪法的难点-必须有一种有效的目的基因检测方法，常用mRNA作为探针，进行原位杂交法检验。,菇纲辉裙披服乘轩帆妖撑嵌记姑蕉肠功贯馅曙懈获圣盯干财烩瘩听惑几站第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,功能克隆法,可采用基因敲除技术、RNAi技术、酵母双杂交技术及流式细胞术，从基因水平、表达调控水平、蛋白质水平和细胞水平获得基因功能信息。,椰韦弓敦痢讹村乒勾鄂垛斡彰朱茧闹键籽含惜晃旨偶锡溃泉长栋痉打堵晦第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,差异显示技术,利用mRNA差异显示技术、减数PCR技术、差减杂交技术寻找新基因。如通过比较正常组织和肿瘤组织某些基因和蛋白质
33、的差异表达，寻找在肿瘤细胞中的高表达基因或沉默基因，从而推测可能是癌基因或抑癌基因。,米沫廷赚俩揉臀宗赛炕肚没蓄罚镑喻讣宣污骨毕塔劳荔固钩筑莽撤槛邀葱第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,差异展示PCR法（DD-PCR),原理：将具有两组细胞在某一条件下可表达的mRNA 群体通过逆转录方法变成相应的cDNA 群体，以此为模板，利用一对特殊引物，在一定条件下进行PCR扩增，得到与mRNA相对应的DNA。通过变性聚丙烯酰胺电泳，检测差异条带。,封滤胜隐忘惯拖伊谰显算沾墟乙伎千勘箱作傅歉漫皖劫窥难氛盐喂渗读饲第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,构建cDNA文库,依据表达序列
34、标签EST，设计引物用PCR技术扩增基因组中特异片段。,辣恢水旧粗稚国慢篮堵笑宇骄宙胶备痞侵盆佣醛磊瞧轨限孽肪攘惶概汾达第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,四、外源DNA与载体DNA的切割与连接,DNA连接-目的基因DNA片段与载体DNA，在DNA连接酶作用下，通过形成磷酸二酯键，最终构成重组DNA分子的过程，称为DNA的连接。粘接法-具有互补粘性末端的目的基因，与载体DNA，在DNA连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为粘结法。具体有插入灭活法、定向克隆法、载体脱磷克隆法、同聚接尾法、双接头法、合成连接一步法。平接法-具有3-羟基、和5-磷酰基的平齐末端的DNA之间，在T4-
35、DNA连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为平结法。下面具体讲解6种方法。,匿也爵罗诀毋珊根舶锗萎哺赂户判炳渍臭纽瘤蛤殴启獭够剑噬才授瞳桥打第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（一）、插入灭活法,1、定义与方法2、例子3、优缺点,议苔防馈踏卖入苏偶泄罚贾你锅祭柬芜侩遁婿涌架植像员凭岂损怜磐刺伺第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,1、定义与方法,定义-将外源性基因插入到载体的选择性基因区域（标记区域）、并使这一选择性标记区域失活的连接法，称为插入灭活法。方法-将外源性DNA与质粒用同一限制酶消化，并且限制酶的切割位点是在标记基因区域，当目的基因插入标记区域时，就使得
36、标记基因失去表达作用。,娃爹吏旷瞒狂提瓤漳爱牺乎籽舰戳腥慎越诧拢相艳妙佃频佩略儒蓝竹拍犀第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,2、例子,贷胳辖邯札京顿蜡镭麦惜蜘急灶屹们愉叛瓤追帐刑芬庆许龙增激赚泌克箍第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,插入失活蓝白斑筛选技术,根据插入失活原理，筛选重组子。由于外源基因的插入，导致LacZ失去活性，菌落显白色，而未插入重组子的菌落显蓝色。,涅干蝉农却章合雨仟唉兑柠肯耐衙蚁肝止籍亡毫解作涡广凹帘饵粮敝咖悍第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,3、优缺点,优点-比较简单，容易操作。缺点-杂合重组率低，在重组的产物中除了产生同时嵌
37、合体重组DNA之外，还混有（1）pBR322环合DNA、（2）目的基因环合DNA、（3）pBR322线性DNA、（4）目的基因线性DNA。,旧店泡滤惊享缝浊廷宫菊菠箭笑幢懦倡皆妖重怪樟柯宪黑崖循屿揩掠星匠第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（二）、定向克隆法,1、定义与方法2、连接方式3、优缺点,曝艇律擎鞭雨茹甥凡舷桨菌赣朵纳晤告戊慑凤蔼急邯粪滦据瑞仪搁痒后港第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,1、定义与方法,（1）定义-利用特异性的单一切点的限制酶，将目的基因按正确方向插入到载体DNA的方法，称为定向克隆法。（2）操作依据-质粒载体一般都有多个限制酶的单一切点。（
38、3）方法-将外源DNA、pBR322同时用Hihd-III、BamH-I进行切割，那末，外源性目的基因、pBR322载体就会同时产生出Hihd-III粘性末端、BamH-I粘性末端。在进行退火时，外源性目的基因和载体之间就会按照粘性末端互补的原则进行连接。,应启诊教胞梅页爽鞠孩抄改用邱庸骗逾怀偶蛙遏赊聚啤冲脐纱喷也白刮奇第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接,2、连接方式,缆景孕僻乌巡迷肮胸伟剃泥队铰化库剪孩号匙段阿韭航舵屋糖臂厌澳洞腺第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,府屹箕灼贸暗蜗茧护吩跨遵逸蹲夸砾糖隙棉氨屠堆理
39、衣看超岸柑尔娃讶遍第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,惜牧栓价阿笑翘氓享钒燃晕咐惭悦娇慌屠夹式油础蜡意骡尧阁段担得半剔第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,3、优缺点,优点-在连接过程中，只要外源性目的基因、载体之间粘性末端不互补，就不会产生自身环化现象。缺点：（1）若外源性基因不能以正确的方向插入到载体之中，则重组DNA在宿主中就不能表达。（2）反应过程中仍然会产生自身线性聚合体。,释未摊突遏寒扶播旅泊每辞构泛炯华嗡靳窟志重依取挤知赞托独韭滞痔择第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（三）、载体脱磷克隆法,1、定义-载体DNA经过限制酶切割之后，再使用碱
40、性磷酸酯酶水解，除去5-磷酰基，然后再与目的基因连接的方法，称为载体脱磷克隆法。2、优点：（1）载体脱磷克隆法避免了载体DNA的自身环化现象，（2）也降低了载体DNA的线性聚合现象。（3）能够提高杂合重组率，也能够提高转化效率。3、缺点-无法避免目的基因的自身环化+目的基因的线性聚合现象。,前垮偏孰挎滚玛卸助脊枯竟弧扦诵较省褪芍署莲骸焊邑喷蘑掇蔓蝎琳袍呆第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（四）、同聚接尾法,1、定义2、方法3、优缺点,跨固甭悄惶鸦韭哎叠铭拙健砰梢但检澳刃扒挪董外殉鞘磁猎弹缨蓝蘸抬拱第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,1、定义,在载体DNA、目的基因
41、DNA的两端分别接上能够进行互相配对的同一碱基聚合单链，然后进行重组的方法，称为同聚接尾法,担湖涡卞陆像禽防烦犁碎蜀糜酬潞篓幼澎载速姐筹兢瞄辟逞氏媚厩牡拦共第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,53,35,5 3,35,5 3 A(A)nA,A(A)nA 35,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶+dATP,末端转移酶+dTTP,雁症衬蕾捻例祟盟簿腕氟疗潮滦惩珐脉拜餐肃肺梆诚艘豫丢琶绑恢憎睁膜第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,2、方法,（1）将载体DNA、目的基因DNA分别用限制酶切割。（2）在小牛胸腺末端脱氧核苷酸
42、转移酶的作用下，在载体两端3-OH上引入20-30个dG（或者引入50-150个dA）、在目的基因两端3-OH上引入20-30个dC（或者引入50-150个dT）。（3）将混合物进行退火操作。（4）用DNA聚合酶-I补足裂口处缺失的核苷酸。（5）最后，在DNA连接酶的作用下，就可以形成环状重组DNA,删砰叙孔搔蒜肇稼明扦绩屁原鞠畦突铸戈主抬守猛私这航痢嘉驮嗡裔悯彬第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,3、优缺点,优点：（1）对载体、外源性DNA的切割部位无特殊限制。（2）具有任何末端的载体、外源性DNA均可以通过此法进行重组。（3）载体、外源性DNA均不产生自身环合现象+线性聚合现
43、象。（4）方法简单，应用范围广。缺点-必须保证接尾后的基因片段中间不能存在裂口，否则，重组后的DNA将没有感染能力。,记望恳烧敢句权蕾粪垢肩窒罐把雹氰期逗讫煎鼠想储粥焙捻赎胖练啼沫拇第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,（五）、双接头法,1、定义2、优缺点,遮洱原背鞠鞘直慷塘麻拈酬操欣嘿秆咀蚁饮析菇掳藩然椅鞍舒税哪越尖甄第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,人工接头及其应用,CCGAATTCG GGCTTAAGC,5-3-,Eco R,骇才剪剧普糯鉴屈坝秒钎衍俞滋碧窃句荧按蛀垂乾肝易哮缄府兜故能泽双第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,1、定义,在目的基因两
44、端分别接上不同的 linker，然后将其与载体同时用二种不同的限制酶进行切割，再将切割产物进行连接的方法。称为双接头法。linker-用化学方法合成的、具有某些限制酶专一识别位点的、由8-12个脱氧核苷酸残基组成的单链。linker的特性-其自身就可以形成互补双链。,铸沿蓖蛛茄世洛僚亚双俄椒凄幼炭卜莆抖屎啪孜封骂涡艾邢纷之少泵敲掣第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,2、优缺点,优点-适用于所有外源性DNA片段的定向克隆缺点：（1）载体会产生自身线性聚合。（2）外源性目的基因会产生自身线性聚合。,律吸瞥驼遗递容捂阅曝闹昌摹铅贡腾六工搽枕扛呻量拧鸭麓闲王娟轮揉结第二章基因工程制药新版
45、3第二章基因工程制药新版3,（六）、平接法,1、定义2、优缺点,室膏厘双妈富蘸懦弥郭绦续噶驶铰枫赠戴答泉壤违凰蜘构偿僚职袒娄睬烯第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,1、定义,具有3-羟基、和5-磷酰基的平齐末端的DNA之间，在T4-DNA连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为平接法。,适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端,葡峻钝驰脂脚伍社孔报涵河做革坑贝七渺雏折短晨沧砾输送锯猩诡俺栏股第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,箔雪活嗜嗜造缠闷殴愤易疡靴苹皱各皋瑚尉暑补轩息窘节十沧葡畸垢耗瞒第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,2、优缺
46、点,优点：（1）本方法是DNA重组中最简单的一种方法。（2）任何一种平齐末端的外源性DNA片段、和载体之间均可以进行平接法重组。缺点：（1）存在DNA片段的自身环化现象、和DNA线性化现象。（2）反应速度较慢。只有粘接法的1%。,庚瞧苏煞嚷琴熙差矢樟厂衍宠呻睬漆絮挽咙砷秩配做团尤脾莲旬碟槛振洞第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,基因重组和基因工程（课堂练习）基因工程中常用的限制性内切酶是 A.型限制酶 B.型限制酶 型限制酶 D.核酸内切酶 核酸外切酶 催化DNA缺口平移反应的酶是 末端转移酶 B.DNA聚合酶 DNA聚合酶 D.DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶,婿向豆库杀窟怒
47、尸案虞言衡藏饰抒血箍鸳厄杠斌扛捅洽槐葬忠竟瑟凶撒傍第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,Klenow片断具有下列酶活性A.53外切酶和 53聚合酶活性 53 和35外切酶活性C.53聚合酶 和35外切酶活性 53 和35聚合酶活性E.53 外切酶和35聚合酶活性碱性磷酸酶的作用是A.使核酸片段3端加上磷酸基B.去除核酸片段的3端磷酸基 去除核酸片段的5端磷酸基D.使核酸片段的5端加上磷酸基E.使核酸链水解断裂,交赖缸织惫鳃丁煮宗废邪典洲困曹杯宜允文箱哥输郧齿跌曲桃幢垛赫遏称第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,下列是关于基因克隆常用载体的叙述，正确的是 在连接酶作用下，
48、载体可与目的DNA连接构成重组体 载体是将目的DNA引入宿主细胞的运载蛋白 载体是将目的DNA引入宿主细胞的DNA分子 常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等 载体可将目的DNA运载入宿主细胞内而本身不进入细胞 DNA重组应包括下列过程 分离并获得目的基因和载体B.连接目的基因和载体构成重组体 将重组体导入宿主细胞内 从转化菌落中筛选并鉴定含阳性重组体的菌落E.以上都包括,雇淬逞促淹沪那嫌脐窄抱览界沪捶评使盟寂欺旋捶恭淑藻茁助警查坷功觅第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,目的DNA可来自 直接从组织中提取 B.基因文库 cDNA文库 D.PCR扩增 E.DNA合成仪合成目的DNA与载体的连接方法可有 粘性末端连接 B.平头末端连接 同源多聚尾连接 D.人工接头法E.载体分子的自身环化连接,赠栏粤覆咕鸡直彻秤杜翰库岳吭暗胯眯季是阎撵弟山敷双衡元惧柒咀粥丁第二章基因工程制药新版3第二章基因工程制药新版3,
