免疫学检测法汇总.docx

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1、免疫学检测法免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于有关免疫疾病的诊断、疗效评 价及发病机制的研究。如对传染病、免疫增殖性疾病、免疫缺损病、超敏反响、 自身免疫病、移植排斥反响肿瘤的免疫学检测，对诊断、治疗均有很大帮助。此 外在医学生物学研究中对抗原性物质或细胞的定性、定量检查不仅推动了对各种 免疫学现象的研究，而且扩大免疫学与医学生物许多领域的联系。本章仅介绍常 用免疫学检测方法的原理，简要过程和实用意义。第一节抗原或挤体的检测一、检测的原理借助挤原和挤体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体 进展定性、定量、定位的检测。1. 挤原与挤体的亲和力(affinity)抗原抗体的结

2、合就像酶与底物的结合，激素 与其受体的结合一样不是化学的反响，而是非共价键的可逆的结合。挤原决定簇 和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度 不同，挤原和抗体分子之间结合力强弱也不同。互补程度高，那么亲和力强。此 外，反响温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特 性也有重要的影响，挤体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。高 亲合力的挤体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原 形成免疫复合物。2. 挤原或抗体外检测原理根据抗原挤体结合形成免疫复合物的性状与活性 特点，对标本中的抗原或挤体进展定性、定位或定量的检测。

3、定性和定位检测比 拟简单，即用的挤体和待检样品混合，经过一段时间，假设有免疫复合物形成的 现象发生，就说明待检样品中有相应的挤原存在。假设无预期的现象发生，那么 说明样品中无相应的挤原存在。同理也可用的抗原检测样品中是否有相应挤体。对抗原或抗体进展定量检测时，以反响中参加挤原和抗体的浓度与形成免疫 复物的浓度呈函数关系。1根据免疫复合物产生的多少来推算样品中挤原或抗体的含量：在 一定的反响条件下，参加的抗体或抗原的浓度一定，反响产生的免疫复合物 多少与侍检样品中含有相应抗原或抗体量成正比。也就是抗体浓度一定时， 免疫复合物越多那么样品中的抗原量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中 抗原或抗体

4、的含量。加免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等 都属于这类方法。2挤原或抗体效价滴定的原理：当抗原挤体复合物形成多少不能反响挤 原挤体反响强弱时，就不能以检测反响强度来对抗原或抗体进展定量。在实际工 作中，把浓度低的反响成分挤原或抗体的浓度固定，把浓度高的另一种反响 成分作一系列稀释。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比拟3只家兔产生抗体 的多少，即滴定3只兔血清挤体效价，可用双向琼脂扩散法来滴定，例如将抗体 浓度固定，将挤原作不同的稀释度，分别将挤原或抗体滴入琼脂的相应小孔中， 观察免疫兔血清与不同稀释度的挤原出现明显沉淀浅的抗原稀释度加甲兔的抗 体效价为1/2000，而丙免的是1/

5、8000那么可比拟出后者此前者产生挤体的效价 要高。也就是表示效价的稀释度越高，样品中所含侍检成分越多。因人血清挤 原和抗体免疫兔血清相比，浓度高，故应稀释挤原。二、抗原或抗体检测的实用意义1. 抗体检测的意义检测挤体可用于评价人和动物免疫功能的指标。挤体用 于临床治疗或实验研究时也需做纯度分析和定量测定。临床上检测病人的挤病原 生物的抗体、挤过敏原的抗体、挤HLA挤原的抗体、血型抗体及各种自身抗体， 对有关疾病的诊断有重要意义。2. 挤原检测的意义可做为挤原进展检测的物质可分为以下四类：1各种微生物及其大分子产物：用于传染病诊断、微生物的分类及鉴定 以及对菌苗、疫苗的研究。2生物体各种大分子

6、物质：包括各种血清蛋白如各类免疫球蛋白、补 体的各种成分、可落性血型物质、多肽类激素、细胞因子及癌胚挤原等均可做 为挤原进展检测。在对这些成分的生物学作用的研究以及各种疾病的诊断有重要 意义。3人和动物细胞的外表分子：包括细胞外表各种分化挤原加6。挤原、 同种异型抗原血型抗原或MHC挤原、病毒相关抗原和肿瘤相关性情抗原等。 检测这些抗原对各种细胞的分类、分化过程及功能研究、对各种与免疫有关的疾 病的诊断及发病机制的研究，均有重要意义。4各种半抗原物质：某些药物、激素和炎症介质等属于小分子的半挤原, 可以分别将它们偶联到大分子的载体上，组成人工结合的完全抗原。用其免疫动 物，制备出各种半挤原的抗

7、体，应用于各种半抗原物质的检测，例如对某些病人 在服用药物后进展血中药物浓度的监测。对运发动进展服用违禁药品的检测，都 是应用半挤原检测的方法。三、抗原或抗体检测的方法由于各种检测方法中所用的抗原性状不同，出现结果的现象也不同。最广泛 应用方法有下述几种：一沉淀反响可落性挤原与挤体结合，在两者比例适宜时，可形成较大的不落性免疫复合 物。在反响体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原挤体反响称为沉淀反响prec ipitation neaction。1. 环状沉淀试验 先将含抗体的未稀释的免疫血清加到直径小于0.5cm 的小试管底部。将稀释的含有可落性挤原的材料重叠于上，让挤原与抗体在两液 体的界面相

8、遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀试验ring precipi tationtest，此法简便易行，需用材料较多是其缺点。2. 单向免疫扩散试验 单向免疫扩散试验single immunodiffusion是在 凝胶中进展的沉淀反响。将挤体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含 有抗体的琼脂板，在适当位置打孔，将挤原材料参加琼脂板的小孔，让挤原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的挤体相遇形成免疫复合物。当复合物体积增 加到一定程度时停顿扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与参 加的抗原浓度成正相关。本方法简便，易于观察结果，可测定抗原的灵敏度最 低浓度约为1020闻/

9、ml,常用于定量测定人或动物血清IgG、IgM、IgA和C3 等，其缺点是需12天才能看结果图20-1图20-1单向免疫扩散试验示意图3. 免疫比浊法 当抗体浓度高，参加少量可落性挤原，即可形成一些肉眼 看不见的水免疫复合物，它可使通过液体的光束发生散射，随着参加挤原增多， 形成的免疫复合物也增多，光散射现象也相应加强。免疫比浊法immunonephe lomytry就是在一定的抗体浓度下，参加一定体积的样品，经过一段时间，用光 散射浊度计nephelometry测量反响液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。 本法敏感、快速简便，可取代单向扩散法定量测定免疫球蛋白的浓度。4,双向免疫扩散试验 双

10、免疫扩散试验double immunodiffusion是在琼 脂板上按一定距离打教个小孔，在相邻的两孔分别放入抗原和抗体材料。当抗原 和挤体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现23条沉淀线，本法常用于抗原成 抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析图20-2。Aki AbaAtlAb2图20-2双向免疫扩散试验示意图5. 对流免疫电泳 对流电泳counterimmunoelectrophoresis是一敏感快速 的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。将琼脂板放入电泳槽，使琼脂板 的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔参加挤原，于正极侧的孔参加抗体，通电 后，挤原带负电荷向正极泳动

11、，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正极 的位移水，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和挤体能较快地集中在两孔之 间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需1小时左右即可观察结果。6. 免疫电泳 免疫电泳。mmunoelectrophoresis）的方法分成两个步骤，即先 进展电泳，再进展琼脂扩散。先将样品参加琼脂中电泳，将挤原各成分依电泳速 度不同而分散开。然后在适当的位置上沿电泳方向挖一直线形槽，于槽参加含有 针对各种抗原混合抗体液，让各挤原成分与相应挤体进展双向免疫扩散，可形成 多答卷沉淀线。常用此法进展血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋白缺损或增多 的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义图20

12、-3。原脂小孔内加人待趋I虬清瀛投挪,1gC血清琼脂取向旷散碍-蜜11清中加G 皂前师矽成沅 津绶图20-3免疫电泳法根本步示决图7.免疫印迹法免疫印迹法immunoblotting又称为Western印迹法，用于AIDS的血清挤体检测。第一步，为电泳别离HIV 抗原，在电场中根据分子量大 小不同病毒挤原各成分散开。第二步，将电泳别离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上 电印迹，然后将印迹有病毒抗原的硝酸纤维膜浸湿于病人血清中。如果病人 血清中含有与一种或几种挤原相对应的挤体的话，那么在该挤原印迹部位形成免疫复合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和抗体后，在膜上加标记的挤入免疫球蛋白 的抗体，此挤体可以和病毒挤

13、原与人挤体形成的免疫复合物发生反响，最后参加 显色底物如果挤入Ig是用酶标记的或做放射自显影挤入Ig用1251标记 以显示结果图20-4。p It1.宣泳分荆M展告病人匝清:土电印通1g岫 F1 P31削W i抗八贝:.加底蝎（或场光）便斥记柱体提州/LJ :-PMj ?PL(50 I 一眦旺j I p t?fpsa&p;?/*p ii图20-4用免疫印迹法检查患音血清中的HIV病毒挤体第一步：经电泳将HIV混合抗合抗原按分子量大水别离;第二步：将已别离的挤原经电印迹转移到硝酸纤维膜上;第三步：将待检病人血清参加覆盖于硝酸纤维膜上;第四步：参加标记的第二挤体使之覆盖膜上;第五步：参加显色底物或

14、放射自显影显现第二挤体二凝集反响细菌、红细胞或外表带有抗原的乳胶颗粒等都是不落性的颗粒挤原，当与相 应挤体结合，挤原与挤体结合形成凝集团块，即称为凝集反响agglutination。1. 直接凝集 直接凝集direct agglutination是将细菌或红细胞与相应抗 体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。可用于传染病诊断加肥达氏反响W idal reaction诊断伤寒病。或利用血细胞凝集现象检查血型。2. 间接凝集 间接凝集indirect agglutination是用可落性挤原包被在乳 胶颗粒或红细胞外表，与相应挤体混合出现的凝集现象。加用y球蛋白包乳胶颗 粒检测类风湿关节炎病人血清

15、中的类风湿因子，用甲状腺球蛋白包被乳胶颗粒用 于检测甲状腺球蛋的抗体。也可以将抗体吸附到乳胶颗粒上检查临床标本中的抗 原，如细菌或真菌性脑膜炎挤体包被的乳颗粒，一旦与含有相应抗原的脑脊液混 台，便可发生凝集，可进展快速诊断。故凝集反响即可测定抗原，也可测挤体， 方法简便、敏感。3. 挤球蛋白试验挤球蛋白试验antiglobulin test,coombs test的原理为间 接凝集试验。例如应用于诊断自身免疫落血性贫血症时，Rh+红细胞与抗朗血 清间的反响。因挤Rh挤体是IgGR有两个结合价，分子较小不如IgM结合价 多，分子大很难直接引起Rh+红细胞凝集。如果参加挤IgG的抗体，就可帮助 挤

16、Rh的IgG的抗体凝集红细胞。也就是经挤Ig的作用提高凝集反响的灵敏度。三补体参与抗原挤体反响这一类反响主要包括落血反响hemolytic assay、补体介导的细胞毒试验 plement mediated cytotoxicuty test及补体结合试验plement fixation test。1. 落血反响抗体与红细胞外表挤原相遇，形成红细胞-挤体复合物即可 使参加反响中的补体活化，导致红细胞落解，此方法可用于红细胞的各种抗原成 相应挤体的检测，此法比凝集反响敏感。落血反响也是用于抗体分泌细胞即空斑 形成细胞PFC检测的原理。2. 补体介导的细胞毒试验各种有核细胞与针对其外表挤原的抗体相

17、遇，所 形成的免疫复合物能活化反响中的补体，弓1起细胞膜穿孔，在一定时间，细胞仍 能维持一定的形态不破碎，参加水落性染如伊红Yeosin 丫或台盼蓝trypan blue后，染料即可进入被活化补体穿孔的细胞，不带相应抗原细胞膜保持完整 的活细胞不着色。此方法可用于带各种抗原的细胞的检测，加进展细胞MHC挤 原的鉴定，和进展淋巴细胞中T细胞总数或其亚类的计数。在一些免疫学实验中 也可用这种方法，根据需要特异地消除带某种抗原的细胞。3. 补体结合试验当抗原可落性或颗粒性与相应挤体结合，由于浓度低 不出现可见反响时，应用补体结合试验可检出此抗原挤体反响，它比凝集反响成 沉淀反响灵敏度高。本法包括两个

18、抗原挤体系统。一为检测系统由侍检样品与抗 原或抗体组成；另一为指示系统，由绵羊红细胞SRBC和挤SRBC组成。 另参加作为补体的新鲜豚鼠血清。试验时试管中先参加检测系统和补体，混合经 37C30分钟使抗原、抗体、补体形成复合物，再参加指示系统，如出现落血现 象，说明检测系统中没有相对应的抗原挤体，补体是游离的指示系统的SRBC和 抗体结合而出现落血，即为反响阴性。如不出现落血，说明检测系统中有抗原抗 体复合物并结合补体，那么指示系统无多余的补体作用而没有落血现象，即为阳 性。在敏感的抗原、抗体检测方法加酶标方法出现之前补体结合试验曾广泛 用于检测各种细菌、病毒或螺旋体加梅毒的抗原或抗体，由于本

19、试验影响因 素多，结果不稳定现已被新检测方法所代替。四、用标记挤体或抗原进展的抗原、抗体反响用荧光素、同位素成酶标记抗体或抗原，用于抗原或抗体检测是目前广泛应 用的敏感、可靠的方法。上述三种常用的标记物与抗原或抗体化学连接之后不改 变后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位检测。1.免疫荧光技术 免疫荧光技术immunofluorescence techni是用化学方 法使荧光素标记的抗体或抗原与组织或细胞中的相应抗原或抗体结合， 进展定性定位检查抗原或挤体的方法。1直接英光法：把荧光挤体加到侍检的细胞悬液，细胞涂片或组织切片 上进展染色，经挤原抗体反响后，洗去未结合的荧光挤体，将待检标本

20、在荧光显 微镜下观察，有荧光的部位即有相应挤原存在，此法可用于病毒感染细胞、带某 种特异抗原的细胞如T细胞和8细胞成病原菌的检查，也可用于组织中沉着 的免疫复合物的检查。本法的缺点是检查多种挤原，就需分别制备相应的多种标 记挤体。2间接荧光法：可克制直接法需制备多种荧光挤体的复杂操作。将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体不标记荧光结合，此为第一挤体，再把能与 第一挤体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白挤体参加，此为荧光标记的第二挤 体，观察结果与直接法一样。间接法比直接法敏感性高，如果用于检查挤原的第 一挤体是人成动物的只需制备一种挤入或动物的免疫球蛋白荧光挤体图20- 5。荧光/氏 抗攻庶惮图2

21、0-5免疫荧光直接法及间接法原理示意图免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染 的疾病，检查抗原或抗体，如查出IgM挤体，可做为近期接触抗原的标志，所以 使用荧光标记挤IgM可诊断近期感染。除微生物学方面的应用外，还可利用单克 隆挤体鉴定淋巴细胞的亚类。使用流式细胞仪（fluorescene-activated cell sorting,FACS），能自动检测细胞的大小、荧光强度。针对细胞外表不同挤原，可以使用两 种不同的荧光染料，如用异硫氰荧光素FITC发黄绿荧光，用罗丹明TMRIT C发红色荧光。由于荧光颜色不同标记两种不同的抗体，对同一细胞进展双标 记染色。对淋

22、巴细胞亚类鉴定起着巨大推动作用。应用间接荧光法也用于自身免 疫病的抗核抗体检查。2.放射免疫分析法放射免疫分析法radioimmunoassay RIA应用竞争性 结合的原理，应作放射性同素标记挤原或抗体与相应抗体或抗原结合， 通过测定抗原挤体结合物的放射活性判断结果，本方法可进展超微量分析，敏感 性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。本法常用的同位素有125 I和 131 I。放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种：1液相法：将待检标本例如含胰岛素挤原与定时的同位素标记的胰 岛素挤原和定时的挤胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，别离收集挤原抗 体复合物及游离的挤原，测定这两局部的射活性，

23、计算结合率。在反响系统中， 待检标本的胰岛素挤原与同位素标记的胰岛素竞争夺战 性与胰岛素挤体结合。 非标记的挤原越多，标记挤原与抗体形成的复合物越少。非标记抗原含量与标记 抗原挤体复合物的量呈一定的函数关系。预先用标准的非标记挤原作成标准曲线 后，即可查出侍检标本中胰岛素的含量图20-6。c一底忙msw素检嫁本 寸抗概与京就牛o o上清使中 游司抗原图20-6液相放射免疫分析法原理及标准曲线2固相法：将抗原或抗体吸附到固相载体外表，然后加待检标本，最后 加标记挤体。测定固相载体的放射活性，常用的固相载体有溴化氰Br海豹化 的纸片或聚苯乙烯小管图20-7。jci(jd未标记的伉原堀度 frig

24、/ml)图20-7固相放射免疫分析法原理放射免疫分析法应用围广泛，包括多种激素胰岛素、生长激素、甲状腺素 等维生素、药物、IgE等。3.1K免疫分析法酶联免疫分析法enzyme immunoassay,EIA是当前应 用最广泛的免疫检测方法。本法将挤原挤体反响的特异性与酶对底物高效催化作 用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定 仪作定量分析，敏感度可达ng水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物i(horser adish peroxidase)、碱性磷酶alkaline phosphatase等。它们与挤体结合不影响 抗体活性。这些酶具有一定的稳定性，制成酶标挤体可

25、保存较长时间。目前常用 的方法有i标免疫组化法和酶联免疫吸附法。前者测定细胞外表挤原成组织的抗 原；后者主要测定可落性抗原或抗体。本法既没有放射性污染又不需昂贵的测试 仪器，所以较放射免疫分析法 易推广。图20-8生物素-酶标亲合素系统反响示意图1酶联免疫吸附试验enzyme linked immunosorbent assay,ELISA:是与 上述固相RIA相似的原理，将抗原或抗体吸附在固相载体外表。使抗原挤体反响 在固相载体外表进展政区。可用间接法、双挤体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。2夹心法sandwich assay :将的特异挤体包装在固相载体塑料板四 孔成纸片上，参加待检标本，标

26、本中的挤原即可与载体上的抗原结合，洗去未 结合的材料后参加该挤原的酶标记挤体，洗去未结合的酶标挤体，加底物显色， 用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。间接法indirecr ELISA常用于检查特异挤体。先将特异挤原包被固相载体， 参加待检标本可能含有相应抗体，再参加酶标挤Ig的挤全即第二挤体， 经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中挤体的含量。3BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改良是使用生物素-亲合素-过氧 化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。 可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞外表挤原等。一个亲合素 avidin分

27、子可以结合4个生物素分子biotin。结合非常稳定。亲合素和生 物素都可与挤全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个挤体 分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检 测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统biotinavidin system- ELISA,BAS-E LISA，它是通过生物素标记挤体连接免疫反响系统，同时借助生物素化酶或酶 标亲合素弓1入酶与底物反响系统。表20-1免疫学测定方法敏感性比拟全屏显示该表格测定方法敏感性每升单向免疫扩散试验 1 2mg双向免疫扩散试验 1mg火箭电泳 0.5mg对流电泳 0.1mg免疫电泳5 10mg凝集试验ipg被动血凝试验ipg血凝抑制试验0.1pg补体结合试验0.1pg放射免疫分析法ipg酶联免疫吸附试验1ng定量免疫荧光分析ipg