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1、1,二代测序技术在血液系统疾病中的应用,2,Sequencing the Human Genome,Year,price,2010,10,8,6,4,2,Trends in Sequencing Technology,2015,三代测序技术,Trends in Sequencing Technology,4,1代测序Sanger Sequencing,利用DNA聚合酶和双脱氧链终止测定DNA核苷酸序列的方法。英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家 Fred Sanger及其同事在1997年发明的。,优点片段长度(900bps)适用于小片段,缺点低通量费用高、耗时长,Trends in Seque
2、ncing Technology,5,二代测序，高通量测序（Next Generation Sequencing、High-throughput Sequencing、Deep Sequencing）:一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，从而可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析。目前主要有Life Tech的SOLiD系列、Ion Torrent PGM和Ion Torrent Proton；Illumina的HiSeq和MiSeq序列；罗氏公司的Roche/454 GS FLX和Junior。,Trends in Sequencing Technology,2代测
3、序Next Generation Sequencing(NGS),通量高准确度高分辨率高,成本下降,Trends in Sequencing Technology,7,High Parallelism is Achieved in Polony Sequencing,Polony,Sanger,8,3代测序单分子测序：HeliScope,DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。第三代测序技术基因组也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序。第三代测序技术发明人：Stephen W Turner&Jonas Korlach 博士基因测序技术逐渐成为临床分子诊断中重要
4、技术手段第三代测序技术的应用在测序、甲基化研究、突变鉴定（SNP检测）,9,三代技术对比,*Source:Shendure&Ji,Nat Biotech,2008,基于NGS肿瘤研究思路,NGS几种方法,全基因组测序,全基因组范围,外显子组测序,1-2%基因组序列,转录组测序,数字表达谱测序,小RNA测序,长链非编码RNA测序,免疫共沉淀测序,甲基化测序,20,NGS在血液系统疾病中的临床应用,全基因组测序（全基因组 3 Billion bp）全外显子测序（30M bp）测序限于基因组1的蛋白质编码区 基因突变 髓系 Myeloid AML预后指标 FLT3,NPM1,CEBPA,ASXL1,
5、IDH1/2 骨髓增生异常综合征(MDS)凝集素及剪切基因经常发生突变 骨髓增生性肿瘤(MPNs)JAK2,CALR,MPL,ASXL1 泛白血病基因淋系 Lymphoid 弥漫性大B细胞淋巴瘤(BCR 信号通路突变)淋巴细胞增殖性疾病(JAK-STAT 信号通路突变)泛淋巴瘤基因 检测复杂的基因组异常-拷贝数变异（CNV）和易位 先天性疾病-骨髓衰竭综合征，先天性溶血性贫血 高度复杂的单基因分析 例如：淋巴细胞克隆性和IGH或TRG/TRB基因,NGS在血液系统疾病的中临床应用路径,AMLMDSALLMPNAPLCML,患者,化疗靶向治疗免疫治疗HSCT,巩固治疗,诊断危险度分层,微小残留病
6、检测（MRD),诊断危险度分层,微小残留病检测（MRD),22,一项癌症基因组图谱研究网络（The Cancer Genome Atlas Research Network，TCGA）的研究200例初诊的AML患者50例全基因组测序，150例外显子测序AML患者中平均有13个基因发生突变23基因突变较为显著（5%的病例）,NGS在AML中的应用,AML基因图谱,Blood.2016 January 7;127(1):2941.,NGS在MDS中的应用,738 例 MDS,MDSMPN患者通过NGS检测了111 个癌症相关基因，结果显示：78%的患者至少有1种致癌基因的突变骨髓或外周血提取DNA
7、没有系统差异致癌基因突变的总数越多，结果越差,髓系肿瘤突变图谱AML,MDS,MPN,MDS/MPN,Matynia et al et al.2015.Archives of Pathology and Laboratory Medicine.,总生存率,复发率,Ivey et al.,N Engl J Med 2016;374:422-33,MRD in Standard-Risk AML,有MRD的患者预后差，复发率高,Ivey et al.,N Engl J Med 2016;374:422-33,MRD in Standard-Risk AML,有MRD携带FLT3-ITD 的患者复发
8、率高,复发无 FLT3-ITD mutations,复发有FLT3-ITD mutations,Ivey et al.,N Engl J Med 2016;374:422-33,MRD in Standard-Risk AML,有MRD携带DNMT3A的患者复发率低,复发without DNMT3A mutations,复发with DNMT3A mutations,NGS在T-ALL中的应用,NGS（外显子测序，全基因组测序或转录组测序）已经鉴定出T-ALL中突变的100多个基因。只有两个基因NOTCH1和CDKN2A/2B在超过50的T-ALL病例中突变，其余基因以较低的频率突变,63个基因的靶向测序（TGS）,NGS在CLL 临床诊疗中的应用,不同的panel针对不同的需求,IG/TCR,展 望,NGS正在为病理学和实验医学带来改革 真正实现“个体化治疗”、“精准治疗”有利于进行靶向治疗 费用的快速降低，技术的持续提高 仍面临的挑战 费用及医保报销政策 数据分析 差异的干扰 其他检测方法的干扰（如 PCR）如今-基因组合（panel）及单基因分析 未来-常规全面的全基因组分析,
