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1、细胞工程,Cell Engineering,Chapter 4、动物细胞培养工程,41 概述 42 生产用动物细胞系43 培养液和培养环境44 动物细胞培养工艺45 动物细胞培养过程的放大与优化46 动物细胞代谢工程47 动物细胞工程产品制备及质控48 动物细胞工程表达产品的应用,41 概述,411 定义：动物细胞培养工程：是指以工业化为目的，应用动物细胞培养的基本原理，研究生物活细胞为主体的生物反应过程，解决动物细胞培养过程中带有共性和特性的工程技术问题的一门应用性科学技术。它依托三部分技术，细胞培养技术（基础）、生化工程技术（过渡）和生物反应器设计（生产技术）。它是大规模生产基因工程药物，
2、单抗和疫苗等生物工程产品的关键技术。,412 发展历程：,413 动物细胞培养的特点与方法：,A、动物细胞培养的主要特点 动物细胞对营养要求高 血清来源受限，质量不稳，研发无血清培养液；动物细胞对培养环境适应性差 生长慢，时间长，生长用动物细胞需驯化；,动物细胞培养对环境条件要求严格 pH，混合气体（O2、CO2、N2）；动物细胞培养过程易产生污染 要求苛刻；各种细胞素长期培养易变异 需监测其形态、生长、表达过程；绝大多数的哺乳类动物细胞具贴壁依赖性生长特征需载体。,B、动物细胞培养工程的方法,悬浮培养：螺旋桨或平桨搅拌通用发酵罐 适应淋巴细胞、骨髓瘤细胞等方法 单层培养 滚瓶法：间歇接触培养
3、液和空气 固定化培养 微珠 微载体培养 比表面积大 中空纤维,414 动物细胞培养工程技术现状与展望 A、70%生物技术产品使用动物细胞生产；B、生产技术、工艺条件改变明显：培养方式：从固着贴壁式变为悬浮式、从间歇式变 为悬浮连续式；培养介质：用动物血清变为无血清无蛋白培养液；生物反应器控制：从黑箱式到计算机到人工智能。,C、中国与美国动物细胞工程技术比较（见表）,中国，实验室规模 流加工艺：产量高易放大、操作简单，美国，产业 如Genentech、IDEC、化规模生产 MedImmune、Merk公司，蛋白质公司 连续灌注工艺：适合不稳定产品、培养利用低、操作复杂、产品回收大，如：Genzy
4、me、Genetic Institute、Bayer公司,D、动物细胞培养工程技术是当今生物制药领域最重要 的关键技术之一；（10000L规模、g/L级）E、大规模动物细胞培养生产中还存在问题需要解决：去除培养环境中外源因子的污染 在线检测与工艺控制，如O2限定与溶解CO2尝试累 积的控制新细胞生物反应器系统的开发利用,42 生产用动物细胞系 421 生产用动物细胞发展：生产用动物细胞是指按生产条件选择、驯化，适于大量培养，用于生产制备生物制品的动物细胞。它经历了原代细胞、二倍体细胞、连续细胞系、融合细胞和重组细胞的历史演化。,422 生产用动物细胞的来源,423 常用生产用动物细胞的特性（参
5、见下表）,424 生产用动物细胞库,生产用动物细胞库:是指为保证生产用动物细胞有稳定和高水平的质量和生物安全性，能够长期、稳定地生产出符合要求的高质量生物制品的储蓄系统。目前，已经制定有三级细库系统相应保存管理措施（档案和技术标准）。,bu,425 生产用动物细胞代谢工程优化改造,A、原因：与原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞相比，动物细胞表达的外源蛋白质最接近天然构想，其生物自身的生长代谢特性并非最佳，为提高培养细胞活性和单位细胞的产率，延长培养周期，必须采用代谢工程方法优化改选宿主细胞，对细胞自身的遗传特性进行功利性修饰。,B、代谢工程（metabolic engineering）：是通过DNA
6、重组技术和分子生物学手段改变酶系功能或物质转动功能，以改进细胞某些方面的代谢活性，进行精确目标的遗传操作。,C、具体优化改选措施：,构建在无血清、无蛋白条件下增殖的细胞株，实现无血清无蛋白培养；（血清是基本添加物，但含未确定成分，如有毒的多胺氧化酶，成本高，来源少，易污染）,敲除或引入动物细胞的乳酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶，减少代谢产物乳酸和氨的产生，以改变细胞能量代谢途径；引入粘附因子纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原或玻璃粘连蛋白，促进细胞贴壁性；构建抗细胞凋亡工程细胞系，增强细胞对恶劣培养条件的抵抗力。（参见下图）,将细胞周期蛋白激酶（CDK）抑制蛋白基因p21和p27引入细胞，获得细胞周期增殖
7、控制的表型，通过调控细胞增殖周期达到调控细胞增殖目的；（参见下图）导入外源性糖基转移酶基因，改变细胞的糖链合成能力，改善重组蛋白糖基化修饰。,43 培养液与培养环境431 动物细胞培养条件,432 动物细胞培养液和添加剂,433 无血清无蛋白培养 优点：化学组分明确，批次间重复性 好，易检测，适合特定过程；缺点：比较贵，针对性强。,434 动物细胞培养用生物反应器,435 培养环境与生物反应器,A、原因 动物细胞生长、代谢和产物生成受培养环境的控制，而生物反应器提供的培养环境能否满足需要，直接与反应器的型式、操作状态有关；为了给细胞生长提供足够的溶氧水平和均一的培养环境，必须使反应器的保持一定
8、的混合水平和通气条件；,动物细胞较大、无壁，它对流体作用力敏感（剪切敏感性），易损，所以，反应器的设计、放大和操作过程必须解决供氧混合与细胞损伤间的矛盾；必须了解生物反应器的传质与混合特性、培养环境液体力学现象对动物细胞生长、代谢及细胞操作的影响；,B、具体关系：,动物细胞对培养环境传质和混合的要求 对于大规模动物细胞培养过程，其生物反应器提供的细胞培养环境必须满足细胞生长、代谢和产物生成对传质和混合的要求，主要因素是细胞生长对氧的要求；反应器的传质能力必须满足：KLA（C*O2-CO2min）qO2C，其中，KL液体一侧氧传质系数，A气液比表面积，qO2单位细胞耗速率，C细胞密度，C*O2液
9、体中氧的饱和浓度，CO2min液体中最低氧浓度。一般而言，提高反应器的能量输入，如增加搅拌转速和通气量 减少气泡直径等，有利于提高传质速率，但增加细 矛盾 胞操作速率,生物反应器设计和操作参数对传质系数有影响：传质系数（KL）受氧在培养液中的扩散速度影响，气泡大小可改变传质系数与扩散系数相互关系，鼓泡式 小气泡（2.5mm）传质系数与扩散系数的 1/2次方成正比。传质比表面积（A）与通气量成正比，而与气泡直径 的三次方成反比，如增加气量、减少气泡直径，会提高细胞死亡率 实际要优化细胞破损与供氧混合过程，在最大限度满足细胞对传质要求的前提下，减少细胞破损。,传质系数（KL）氧传质系数仍与扩散 系
10、数的2/3次方成正比，但流体主体通气搅拌 的湍（tuan）流强度对传质系数也有贡献 生物反应器 气液传质比表面积（A）气泡直径和传 质比表面积主要与搅拌功率和通气 量有关 强化传质和抑制细胞损伤，达到合适度（优化）,决定动物细胞剪切敏感性的因素：不同细胞剪切敏感性不一，人细胞最敏感，细胞表面形 态与功能特性（细胞膜流动性）直接决定细胞剪切 敏感性，流动性越强，剪切越敏感，如杂交瘤细胞；细胞骨架结构影响细胞耐剪切能力；细胞所处生长期（生理状态）对细胞耐受剪切力有影响。微载体细胞培养系统中的细胞损伤微载体湍流涡旋 相互作用是主要因素；悬浮细胞在生物反应器中的细胞损伤鼓泡式、气升 式相对温和，决定于
11、气泡聚并与破裂速率；,防止细胞机械破裂的培养液成分,44 动物细胞培养工艺,动物细胞培养工艺是指动物细胞表达生物技术产品的生产工艺；动物细胞表达产品的种类繁多，生物合成各具特点，其培养工艺过程也不同；动物细胞培养工艺的设计要根据细胞本身的生长特点、生长形式、目标产品的表达量、稳定性等进行综合考虑，以选择相应的生物反应器系统，确定培养条件、培养环境和各种参数控制指标等；目前，成熟的蛋白治疗药物生产工艺有：流加培养工艺、灌注培养工艺、批式培养工艺和反复批式培养工艺。,441 动物细胞培养工艺基础,实验室规模（laboratory scale）A、工艺实验研修阶段 中试规模（pilot scale）
12、生产规模（production scale）实验室设施B、实验室管理 选址、装修、净化、布局 无菌室管理（国家相关法规）D、无菌操作技术 培养前准备、培养室和超净台的消毒、洗手与着装 无菌培养操作、生物反应器的安装与消毒,442 动物细胞培养方法,原代细胞 依细胞来源，可分 传代细胞培养 液体培养 依培养液种类不同，可分 固定培养 静止培养、旋转培养、搅拌培养 依反应器类型和操 中空纤维培养 作方式不同，可分 固定床或流化床培养 悬浮培养 依在反应器生长 贴壁培养 形式不同，可分 贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）,A、悬浮培养（suspension culture）：,是指细胞自由地悬浮于培养液内
13、生长增殖的一种培养方法；适用于悬浮培养的生产细胞有杂交瘤与骨髓瘤细胞（SP2/0，NSO），不适用于正常细胞培养。此种方法操作简便，传质比较好，易放大，条件均一；但需产物截流。1996-2000年，美国，FDA批准70%重组治疗药物。,用重组技术或细胞融合技术建立的工程细胞系，在进行无血清悬浮培养或高密度培养时，都需经过一定时间的细胞适应能力驯化；细胞对无血清培养条件的适应能力和生长形式的驯化，对于建立优化的无血清高密度培养工艺非常重要；,通过驯化期可以逐渐修复那些不适应的细胞群体，在驯化过程中监控并筛选那些具有优化性能特性（如细胞生长率、产出率、细胞死亡率、基因稳定性等）的细胞克隆或细胞群；
14、悬浮培养 无血清培养条件的驯化 的驯化 高细胞密度培养的驯化 主要包括（时间、难度不一）贴壁生长转化为悬浮生长的驯化,B、贴壁培养（anchorage-dependent culture）,是指让细胞贴附在某种基质上进行增殖的培养方法。主要适用于贴壁细胞或兼性贴壁细胞，如CHO、BHK、Vero等，用灌流培养模式可维持较长的培养周期，关键是提高细胞密度，进行放大培养；适于贴壁依赖性和非依赖性细胞。优点：易于灌注和优化控制，细胞生长密度高，产率高，产物易收取和纯化，培养液利用率高；,433 动物细胞培养的操作方式,444 培养过程的监测与控制,445 动物细胞培养工艺,446 工艺的选择与设计（
15、反应器投入占整个部分50%）,B、生产工艺的设计原则,447 杂交瘤细胞大规模培养制备 抗体的工艺,A、工艺流程图肝癌单抗片段Hab18F（ab/）2体外制备工艺,B、主要设备,1L悬浮搅拌培养瓶Superspinner（德，BraunBiotech）杂交瘤细胞悬浮培养种子细胞（磁力搅拌无气泡供气，10um细胞连续 旋转过滤器，其它全控）5L细胞发酵罐（德国，BraunBiotech）杂交瘤细胞连续悬浮培养 30L细胞发酵罐BiostatRC20（德国，BraunBiotech）（冷热循环蒸汽控温，四气混合控制供气）杂交瘤细胞连续悬浮培养的放大,生物反应器,生物反应器的操作,生物反应器的监控系
16、统,生物反应器连接和排流管道,低温调整离心机,系统控制面板,国产生物反应器及操作,C、无血清流加培养工艺,45 动物细胞培养过程的 放大与优化451 动物细胞培养工艺的研究,A、开发重要性：真核细胞表达产物糖基化，有疗效；动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期长，研发成本高，技术难度大；如：美国，Immunex公司，已被Amgen公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白药物，26g/人、年6154美元/g=16000美元，2002年，销售额达8.02亿美元，其中，被替代损失10亿，因为产量低，计划投入数亿美元，耗时3-5年，扩大规模、优化生产工艺
17、，提高产量B、主要内容：生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性C、初步研究：首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细胞培养工艺。,452 动物细胞培养工艺的优化,A、影响蛋白质产量的关键参数，营养物耗尽；B、决定细胞浓度 有毒废物的积累 的关键参数 培养物理条件的恶化 提高蛋白质表达水平C、细胞培养工艺 细胞新陈代谢的控制 优化策略 流加工艺的优化,453 动物细胞培养工艺的放大,A、生物反应器尺寸放大 鼓泡B、氧气的传输 提高氧气传递的其它方法 搅拌速率和搅拌器的设计C、混合 剪切力和细胞损伤D、工业生产中的动物细胞培养,46 动物细胞代谢工程,461 概述 A、生命的代谢活动是通过活
18、细胞和细胞群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳，需要对细胞代谢途径进行修饰；,B、代谢控制发酵（metabolic control fermentetion）是指利用遗传学或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵；C、在代谢控制发酵的理论基础上，提出和形成了“代谢工程”概念；,D、代谢工程（也称途径工程，pathway engineering）是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶
19、的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络有目的地被修饰。,462 基本原理,A、代谢网络理论细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又互相协调；代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔性节点；柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；,生物合成相关代谢调节和调节网络理论代谢工程 代谢流及节点分析 理论涉及 碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计 主要
20、内容 中心代谢产物作用机制及相关代谢分析B、代谢流及中间产物分析静态分析C、代谢控制分析动态分析,463 代谢调节的基本类型及其机制,A、代谢调节的基本类型 直线式代谢的反馈控制 协作式多价反馈控制 合作反馈控制 累积反馈控制 顺序反馈控制 同工酶控制,B、酶合成及酶活性的调节机制 末端代谢产物阻遏酶的阻遏 酶合成的分解代谢物阻遏和酶的诱导 酶的诱导与合成 变构 酶活性的调节 同工 多功能酶,464 代谢工程的研究方法,A、设计思路改变代谢流 扩展代谢途径和构建新的代谢途径 常规方法分子生物、生化、物化 代谢通量分析（MFA）静态B、研究 代谢控制分析（MCA）动态 方法 代谢网络 生化系统理
21、论（BST）最优化原理 定量分析 控制论模型（CM）非线性 途径分析途径定位,细胞代谢模型C、代谢模型的 发展与优化 神经网络 计算生物学方法 遗传算法 D、逆代谢工程,47 动物细胞工程产品制备及质控,471 动物细胞工程产品制备 A、初级分离离心、过滤、吸附 B、纯化色谱法 C、制剂与冷冻干燥,472 动物细胞工程产品的质量控制,PAGE 纯度 SDS-PAGE 液相色谱 A、物化指标测定 含量 B、安全性评介 分子量 C、稳定性,48 动物细胞工程表达产品的应用,481 重组蛋白药物,A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体 Tenecteplase，商品名TNKaseTM，急性心肌梗
22、死病人溶栓治疗，人t-PA基因位于8号染色体p12-q11.2，全长36594bp，14个外显子，13个内含子，t-PA由527个氨基酸，单链糖蛋白，开始 酵母表达，不能分离纯化 t-PA突变体，由双链糖蛋白，现用CHO细胞高效表达成功（参见下图）,B、-干扰素（IFN-）,最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，,天然IFN-刺激体外培养人成纤维细胞，大肠杆菌表达，活性低，不稳定，Cys17形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化 重组IFN-点突变
23、改造，使Cys17变为中性氨基酸，如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-1b CHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化，分离简单。,C、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）D、血友病缺少凝血因子（F）或含量过低疾病,482 MAb药物（参见下图）,因为体内同一抗原具多个表位，刺 激机体产生不同抗体（多克隆抗体）杂交瘤技术能将多克隆抗体纯化为具 有高度均一性，抗原识别专一性的MAb，降低抗原识别交叉反应；,483基因工程与亚单位疫苗,A、乙肝疫苗（参见下图）,衣壳衣壳表面抗原（HBsAg），核心抗原 核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和核酸 第一代疫苗，血中提取，弱反应，10%不产生反应，81
24、-82年，美法，85年，中国 第二代疫苗，在哺乳细胞或CHO细胞表达，81年，法美，91、92年，中国 第三代疫苗，PreS抗原（重要作用），CHO细胞表达,B、艾滋病疫苗（参见下图）,CHO表达疫苗理论上，有致瘤性昆虫细胞表达疫苗昆虫细胞-杆状病毒表达系统（安全性好，容量大，表达效率高）,C、肿瘤疫苗,灭活自体肿瘤细胞 对细胞因子基因修饰，主动 加强疫苗免疫原性 免疫 同种异体的肿瘤细胞 树突状细胞（抗原提呈细胞）体内外诱导CTL生成 激发特异性抗肿瘤免疫功能,484 基因治疗产品,基因治疗（gene therapy）是指把外界的正常基因或治疗基因通过载体转入特定靶细胞，以最终预防或改变特殊
25、疾病状态的治疗方法。基因的转移可通过物理或化学的方法，也可通过各种病毒或非病毒载体的介导，还可通过改造细胞（造血干细胞、成纤维细胞、骨髓肌细胞、肝细胞、神经细胞）进行细胞治疗。,A、神经系统疾病的基因或细胞治疗：,B、造血干细胞治疗癌症 HSC基因（参见下图）,胰岛素依赖型（I）C、细胞、基因 代谢 治疗糖尿病 紊乱 非胰岛素依赖型（II）,【习题】1、名词解释，并简要说明它们间关系：单抗与疫苗 CHO、BHK与Vero tPA与EPO 艾滋病疫苗与肿瘤疫苗2、从多个方面比较动植物细胞与微生物细胞培 养特性、条件与方式？3、简述生产用动物细胞系的来源及特点？4、概述肝癌单抗片段HAB18F(ab)2无血清流 加培养工艺技术流程？,
