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1、现代生物技术概论,授课36节任课教师：周盛TEL：,请你了解我,周盛，华南理工大学工学博士主要研究方向：环境微生物学及分子生态学曾在企业当过技术员，工程师，总工程师，副厂长。,至于做教师，我是半路出家。我的教学原则：实用主义,第1章 现代生物技术总论,第一节 生物技术的含义一 生物技术的定义生物技术(biotechnology),有时也称生物工程(bioengineering),是指人们以现代生命科学为基础,结合其他基础学科的科学原理,采用先进的工程技术手段,按照预先的设计改造生物体或加工生原料,为人类生产出所需产品或达到某种目的.,现代生物技术是以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志的
2、。物技术时期关键以分子生物学的理论为先导，基因工程技术开始能作为生物技术新产品的一种开发手段或关键技术后起始的。,生物技术的种类及其相互关系 1 基因工程 基因工程(gene engineering)是20世纪70年 代以后兴起的一门新技术,其主要原理是应用人 工方法的生物的遗传物质,通常是脱氧核糖核酸(DNA)分离出来,在体外进行切割,拼接和重组,然 后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体,从 而改变它们的遗传品性;有时还使新的遗传信息(基因)在新的宿主细胞或个体中大量表达,以获 得基因产物(多太或蛋白质).,2.细胞工程 细胞工程(cell engineering)是指以细胞为基本单位,
3、在体外条件下进行培养,繁殖;或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变,从而达到改良生物品种和创造新品种;或加速繁育动、植物个体;或获得某种有用的物质的过程.3 酶工程酶工程(enzyme engineering)是利用酶,细胞器或细胞所具有的特异催化功能,对酶进行修饰改造,并借助生物反应器和工过程来生产人类所需产品的一项技术.,4 发酵工程利用微生物生长速度快,生长条件简单以及代谢过程特殊等特点,在合适条件下,通过现代工程技术手段,由微生物的某种特定功能生产出人类所需的产品称为发酵工程.5 蛋白质工程蛋白质工程(protein engineering)是指在基因工程的基础上,结合蛋白质
4、结晶学,计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识,通过对基因的人工定向改造等手段,从而达到对蛋白质进行修饰,改造,拼接以产生能满足人类需用要的新型蛋白质的技术.,五大工程相互关系,生化工程,生物化学工程是生物化学反应的工程应用，主要包括了发酵工程下游技术。即后提取。,第二节，第三节 不讲,第四节 现代生物技术的应用及发展前途,应用：一、提高生命质量，延长人类寿命二、解决能源危机、治理环境污染三、改善农业生产、解决食品短缺,一、提高生命质量，延长人类寿命（一）用于开发新型药品 1977年，美国首先采用大肠杆菌作为基因工程菌生产了人类第一个基因工程药物人生长激素释放抑制激素，开辟了药物生产的新
5、纪元。若采用常规方法生产5mg该激素，则需要50万头羊的下丘脑，而用大肠杆菌基因工程法生产同等量生长激素释放抑制激素，则仅需9L（升）细菌发酵液，使其价格隆到每克300美元。,如今通过基因工程琳琅满目如生物活性物质酶、激素、疫苗、干扰素、免疫球蛋白、白细胞介素、生长因子、集落刺激因子等。,过分依赖抗生素催生超级细菌 噩梦或从此开始,最近，“超级细菌”肆虐，据报道，一些赴印度接受治疗的患者感染了一种新型超级细菌，其含有一种叫NDM-1的基因。这种细菌对现有的绝大多数抗生素都“刀枪不入”，甚至对碳青霉烯类抗生素也具有耐药性，而碳青霉烯类抗生素通常被认为是紧急治疗抗药性病症的最后方法。这种变种超级细
6、菌目前已经传播到英国、美国、加拿大、澳大利亚、荷兰等国家，有可能进一步在全世界蔓延。有专家甚至认为，这可能预示着人类抗生素时代的终结。,“超级细菌”增多新药研制赶不上耐药菌繁殖有75%感冒患者使用抗生素，视为“万能药”抗菌药的三大不良反应：毒性反应 过敏反应 二重感染,毒性反应肾脏：氨基糖苷类、多黏菌素类、四环素类、万古霉素、磺胺药等均可导致不同程度的肾脏损害。肝脏：红霉素类、磺胺类、利福平、氯霉素等均可引起肝损害。胃肠道：各类抗菌药物尤其口服给药者均可由药物本身刺激作用引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻等反应。神经精神系统：青霉素类可对大脑皮层产生直接刺激，出现肌阵挛、惊厥、癫痫、昏迷等；链霉素、卡
7、那霉素等均可损害第八对脑神经，导致听力或前庭功能损害；氯霉素、普鲁卡因霉素等有时可引起幻觉、幻听、定向力丧失等精神症状。造血系统：氯霉素、磺胺类、头孢菌素类可能引起贫血、再生障碍性贫血。,过敏反应过敏性休克：青霉素所致者最常见，链霉素所致也较多见，头孢菌素类、红霉素等偶亦可引起。药疹及药物热：多见使用青霉素、链霉素、磺胺药等，药物热可与药疹同时出现，也可单独发生。光敏反应：服药期间在暴露部位出现皮疹，四环素类以及某些喹诺酮类较多见，严重者可出现皮肤红肿、水疱等。血管神经性水肿、血清病样反应：大多由青霉素引起。二重感染此为应用抗菌药物中出现的新感染，在长期应用广谱抗菌药物的患者中较多见。广谱抗菌
8、药物可抑制人体内敏感菌的生长，导致耐药菌大量繁殖，成为优势菌，此时如各种原发疾病、大手术等使机体免疫功能受损，优势菌就可引起消化道、肺部、尿路、血流等感染，且治疗困难，病死率较高。,（二）用于疾病的预防和诊治由于传统的疫苗生产方法对某些疫苗的生产和使用存在着免疫效果不佳、被免疫者有被感染的风险等缺点，较多的基因工程式法生产重组疫苗则可达到安全、高效的目的，现已临床广泛而目前应用的基因重组疫苗有病毒性肝炎疫苗（包括甲肝和乙肝疫苗等）、肠道传染病疫苗（包括零乱和痢疾等）、寄生虫疫苗（包括疟疾和血吸虫等）、流行性出血热疫苗、EB病毒疫苗等。,利用细胞工程技术生产单克隆抗体则为利用生物技术进行疾病防治
9、的另一途径。例如：用于治疗肿瘤的“生物导弹”，就是将用于治疗肿瘤的药物与抗肿瘤细胞连接在一起，利用抗原抗体结合的高度专一性，使得抗肿瘤药物集中于肿瘤部位，以达到高效杀伤肿瘤细胞并减少对正常细胞的毒性反应。此外。还可以应用基因工程技术生产诊断用DNA试剂，称为DNA探针，主要用于诊断遗传性疾病和各种传染病等。,一种“超级病菌”已经从南亚传入英国，并很可能向全球蔓延,抗生素是人类抵御细菌感染类疾病的主要武器。但是，最近，这种武器遭到巨大挑战。医学权威杂志柳叶刀11日刊登的一篇论文警告说，研究者已经发现一种“超级病菌”，它可以让致病细菌变得无比强大，抵御几乎所有抗生素。目前，这种“超级病菌”已经从南
10、亚传入英国，并很可能向全球蔓延,（三）用于基因治疗基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。目前，基因治疗已涉及到恶性肿瘤、遗传病、代谢性疾病、传染病等多种疾病。,(一)治疗性基因的获得(二)基因载体的选择(三)靶细胞的选择(四)基因转移方法(五)转导细胞的选择鉴定(六)回输体内,基因治疗策略,目的基因的转移在基因治疗中迄今所应用的目的基因转移方
11、法可分为两大类：病毒方法和非病毒方法。基因转移的病毒方法中，RNA和DNA病毒都可用为基因转移的载体。常用的有反转录病毒载体和腺病毒载体。转移的基本过程是将目的基因重组到病毒基因组中，然后把重组病毒感染宿主细胞，以使目的基因能整合到宿主基因组内。非病毒方法有磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、显微注射法等。,基因治疗的基本步骤,目的基因的表达目的基因的表达是基因治疗的关键之一。为此，可运用连锁基因扩增等方法适当提高外源基因在细胞中的拷贝数。在重组病毒上连接启动子或增强子等基因表达的控制信号，使整合在宿主基因组中的新基因高效表达，产生所需的某种蛋白质。,安全措施为避免基因治疗的风险，在应用于临床之前，必
12、须保证转移-表达系统绝对安全，使新基因在宿主细胞表达后不危害细胞和人体自身，不引起癌基因的激活和抗癌基因的失活等，尤其是在将反转录载体用于基因转移时，必须在应用到人体前预先在人骨髓细胞、小鼠体内和灵长类动物体内进行类似的研究，以确保治疗的安全性。,（四）人类基因组计划从整体上研究人类的基因组，分析人类基因组全部序列以获得人类基因所携带的全部遗传信息。该计划的实施极大地促进了生命科学领域一系列基础研究的发展，进一步阐明基因的结构与功能关系、生命的起源和进化、细胞发育、分化的分子机制及疾病发生的机制等，为人类自身疾病诊断和治疗提供依据，为医药产业带来了翻来覆去的变化。,二、解决能源危机、治理环境污
13、染（一）解决能源危机生物能源是最有希望的新能源之一，通过微生物发酵或固定化酶技术，将工、农业废弃物变为沼气或氢气，将是一种取之不尽、用之不竭的能源。应用生物技术，加入能分解蜡质的微生物后，利用微生物分解蜡质使石油流动性增加而获得更多的石油，被称为三次采油。,一般认为起驱油作用的是微生物产生的气体和表面活性剂,还有产酸作用、对原油的降解作用。微生物注入地层后,通过间隙水与临近的油滴结合之后运移,微生物吸附于油滴边界,将烃类分子转化成有机溶剂、表面活性剂、酸、醇和气体。有机溶剂溶解于石油,降低其粘度,提高有效渗透率;表面活性剂可降低油与岩石和油与水的界面张力，提高驱油效率,改变岩石润湿性,使岩石更
14、加水湿;消除岩石孔壁油膜,提高油相流动能力;分散乳化原油,降低原油粘度。,微生物采油,国际能源网讯：美国加州大学洛杉矶分校的科学家于2009年12月中旬宣布，他们成功开发出一种能将二氧化碳转化为液体燃料的转基因蓝藻。这种蓝藻能通过光合作用消耗二氧化碳并产生异丁醇。该研究被认为具有较大的应用价值。据介绍，通过基因技术，研究人员首先增加了聚球蓝藻菌中具有吸收二氧化碳作用的核酮糖二磷酸羧化酶（RuBisCO）的数量。而后又插入了其他微生物的基因以增强其对二氧化碳的吸收能力。通过光合作用，转基因蓝藻就可以产生异丁醇气体。这种气体具有沸点低，承压能力强的特点，容易从系统中分离。研究人员称，这种新方法有两
15、个优势：第一，它能回收二氧化碳，有助于减少由燃烧化石燃料所产生的温室气体；第二，它能将太阳能和二氧化碳转化为燃料，并应用于现有的能源设施和大多数汽车上。除此之外，与其他汽油替代方案相比，这种转基因海藻在转化过程中不需要中间步骤，可直接将二氧化碳转化为燃料。,把二氧化碳直接转化为液体燃料的细菌,（二）保护环境1、微生物脱硫治理空气污染2、运用生物技术处理、净化污水3、应用生物农药控制病虫害4、使用基因工程生产可降解塑料,运用生物技术处理、净化污水,解决白色污染的替代材料是微生物生产的PHA 塑料被称为白色污染，是近年来环境的大敌。以聚乙烯为代表的塑料，在自然条件下极难降解，在土里埋50100年仍
16、旧安然无恙。由于塑料广泛应用于农业生产及日常生活中，造成了这种人工化合物的大量积累。积累在农田中的塑料可导致土壤板结，活力下降，防碍作物生长，可使作物减产2040%。现在人们正在积极寻找可以取代原有塑料的可生物降解的新材料。一类由微生物合成的化合物引起了人们的兴趣，这类化合物为聚-羟基烷酸酯，简称PHA，它们是由许多个-羟基化的饱和脂肪酸聚合而成的。脂肪酸可以是丁酸，戊酸或己酸等。,三、改善农业生产、解决食品短缺（一）有利于提高农作物的产量和品质（二）有助于发展畜牧业生产,生化武器,生化武器是指以细菌、病毒、毒素等使人、动物、植物致病或死亡的物质材料制成的武器。作为一种大规模杀伤性武器，至今仍
17、然对人类构成重大威胁。它包括生物武器和化学武器。,当前和今后的生物武器研究的重点主要表现在如下几方面：一、是毒素类战剂成为研究的热点。毒素是由细菌、微生物、动物、植物和真菌等生物体产生的有毒化学物质，这类战剂又称生物化学战剂，其毒性比现有化学战剂高出1001000倍，并难于检测和核查。二、是运用分子遗传学方法研究和改造各种生物战剂。通过基因重组，使致病的细菌和病毒中接人能抗普通疫苗或药物的基因，使感染者难以治愈；或者在一些非致病微生物体内“插入”致病基因，制造出新的生物战剂。例如，在相中接人炭疽病基因，将眼镜蛇毒液的基因“插入”流感病毒等。,三、是研究提高生物战剂杀伤效应的技术。施放方法对生物
18、战剂的杀伤效果影响很大。研究表明，以气溶胶形式施放生物战刘是使用生物武器的主要手段。一些国家很重视提高气溶胶的发生率、稳定性、感染力及控制气溶胶粒度的研究。四、是利用现代生物技术特别是基因工程发展新型生物战剂。生物战剂已经从由自然界筛选致病微生物与毒素发展到利用DNA重组与蛋白质工程技术改造、构建新的致病微生物和毒素的阶段。,第2章 基因工程,基因工程的特点1.打破了物种的界限,突破了亲缘关系的限制可以大大加快变异的程度，例如,通过基因工程技术,可使人的生长激素基因在大肠杆菌中进行表达,从而通过微生物发酵来获得人生长激素。2.可进行定向变异和育种这也是普通微生物遗传学方法所做不到的，例如,可以
19、将固氮微生物的基因引入到非豆科植物中,从而创造出能够固氮的非豆科作物。3.可创造出自然界中原本没有的生物,基因工程的主要操作步骤,基因工程的基本操作,1.目的基因的取得选择目的基因的途径有3种：选择适宜的给体细胞,以便从中采集分离到有生产意义的目的基因；通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA)；用化学方法合成特定功能的基因。通过PCR把目的基因扩增出来,选择适宜的给体细胞,以便从中采集分离到有生产意义的目的基因；,通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA)；,用化学方法合成特定功能的基因。,通过PCR把目的基因扩增出来,动画原理,2.选择载体载体必须具备下列几个条件:
20、是一个有自我复制能力的复制子;能在受体细胞内大量增殖,有较高的拷贝数最好只有一个限制性内切酶的切口,使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置载体上必须有一种选择性遗传标记,如具有四环素、氨苄青霉素等的抗性基因,以便及时把极少数“工程菌”选择出来。,载体的种类微生物基因工程所用的载体大肠杆菌质粒,穿梭质粒载体,噬菌体载体,植物基因工程所用的载体植物病毒DNA载体已用于构建植物载体的有双链病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)，单敛病毒番茄金黄花叶病毒(TGMV),非洲木薯花叶病毒(ACMV),玉米线条病毒(maize streak virus MSV)，小麦矮缩病毒(WDV),以及RNA病毒雀麦草花
21、叶病毒(BMV),大麦条纹花叶病毒(BSMV),蕃茄丛矮病毒(TBSV),马铃薯X病毒(PVX),烟草花叶病毒(TMV),烟草蚀刻病毒(TEV),李痘病毒(PPV)等.构建植物病毒克隆载体的基本策略是对病毒DNA(包括RNA反转录的DNA)进行加工,消除其对植物的致病性,保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性,使携带的目的基因导入植物细胞.,植物基因克隆的载体Ti质粒（1）Ti质粒的结构和特性致癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有一种内源质粒,当农杆菌同植物接触时,这种质粒会引发植物产生肿瘤(冠瘿瘤),所以称此质粒为Ti质粒(tumor inducing pla
22、smid)。能进入植物细胞的只是一小部分，约25kb，称为T-DNA(transfer DNA)。T-DNA左右两边界（LB，RB）各有一个25kb长的正向重复序列（LTS和RTS），对T-DNA的转移和整合是不可缺少的。,动物基因工程所用的载体目前用于构建克隆载体的动物病毒有痘苗病毒,腺病毒,杆状病毒,猿猴空泡病毒和反转录病毒等.,柯斯质粒载体 柯斯质粒（cosmid）是一类由人工构建的含有 DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。1 柯斯质粒载体的组成柯斯质粒的大小为46kb，这类质粒的基因组都由三部分成。一个抗药性标记和一个质粒的复制起始部位。一个或多个限制酶的单一切割位点。
23、一个带有噬菌体的粘性末端片段。,柯斯质粒载体的特点：有以下三个方面的特点：第一，具有噬菌体的特性。第二，具有质载体的特性。第三，具有高容量的克隆能力。,人工染色体克隆载体人工染色体载体实际上是一种“穿梭”载体，含有质粒载体所必备的第一受体（大肠杆菌）内源质粒复制起始位点（ori），还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点，端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。这样的载体与目的DNA片段重组后，在第一受体细胞内按质粒复制形式进行高拷贝复制，再转入指点二受体细胞，按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的转化子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的转化子，常用与
24、受体互补的营养缺陷型。与其他的克隆载体相比，人工染色体载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段，主要用于构建基因组文库，也可用于基因治治疗和基因功能鉴定。酵母人工染色体（YAC）是早期构建的人工染色体 克隆载体，将含有酵母染色体的DNA端粒（TEL），DNA复制起点（ARS）和着丝粒（CEN）以及必要的选择标记（HISA4和TRP）基因和多克隆位点（MSC）的DNA片段克隆到pBR322中，构建成YAC载体，,表达载体诱导型表达载体诱导型表达载体指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体。外源基因处于这样的启动子下，必须在合适的诱导条件下才
25、能表达。目前用作诱导型的启动子有二价金属离子诱导启动子，红光诱导启动子，热诱导启动子和干旱诱导启动子等。组织特异性表达载体在较高等的真核生物中，有一类特殊的调控序列（启动子等）可以调控基因只能在一定的组织中才进行有效的表达。先用这样的调控序列可以构建一系列组织特异性表达载体，为研究动植物以育和人类基因治疗等提供了有效的手段。目前已构建的组织特异性表达载体有乳腺组织特异性表达载体，肿瘤细胞特异性表达载体，神经组织特异性表达载体，花药特异性表达载体和种子特异性表达载体等。,反义表达载体反义核酸技术是目前人工干预基因表达的一项重要技术，它利用人工合成或重组的与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，
26、特异性地与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。此技术已成为基因治疗的重要手段，其中构建反义表达载体就可能在靶细胞内直接产生致病基因的反义RNA片段。将获得的致病基因反向组入表达载体，即可构建成反义表达载体。当反义表达革体导入靶细胞后，就可转录出与致病基因 mRNA互补的反义RNA，特异性地封闭致病基因的表达。,3.目的基因与载体DNA的体外重组对目的基因与载体DNA均采用限制性内切酶处理,从而获得互补粘性末端或人工合成粘性末端。然后把两者放在较低的温度(56)下混合“退火”。由于每一种限制性内切酶 所切断的双链DNA片段和粘性未端有相同的核苷酸组分,所以当两者相混时,凡粘性末端上碱 基互补的片段
27、,就会因氢键的作用而彼此吸引,重新形成双链,这时,在外加连接酶的作用下,供体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被“缝 合”,形成一个完整的有复制能力的环状重组体嵌合体。,连接的几种方法通过粘性末端连接,平末端连接,3.DNA接头（adpater）连接法，是一种具Bam H I粘性末端的典型的有粘性末端的新的DNA分子而易于连接重组。,衔接物连接法 所谓衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平齐末端的双链寡聚核工业苷酸片段。,4.重组载体导入受体细胞 体外反应生成的重组载体只有将其引入受体细胞后,才能使其基因扩增和表达。受体细胞可以
28、是微生物细胞,也可以是动物或植物细胞。目前使用最广泛的是微生物细胞E.coli。其次为枯草杆菌和酿酒酵母。把重组载体DNA分子引入受体细胞的方法很多。若以重组质粒作载体时,可以用转化的手段;若以病毒DNA作重组载体时,则用感染的方法。在理想情况下,上述重组载体进入受体细胞后,能通过自主复制而得到大量扩增,从而使受体细胞表达出供体基因所提供的部分遗传性状,受体细胞就成了“工程菌”。,导入的几种方式转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体 DNA导入受体细胞。电脉冲(电转化)原理：电穿孔是一种方法，利用控制的电流脉冲，使活细胞的细胞膜产生孔道，该孔道是暂时的、可逆的。形成的孔道容许大分子物质，如：
29、DNA、蛋白质、染料或代谢物进入细胞。用途：通过电击可以使大肠杆菌或哺乳动物细胞穿孔。动画原理,转染：以噬菌体为载体，用 DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体菌。这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳 感染：以噬菌体为载体，在体外将噬菌体 DNA包装成病毒颗粒，使其感染受体菌。这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。注射:如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入,2.4.1 受体细胞选择受体细胞时应重点考虑以下几点:安全性高，不会对外界造成生物污染；便于重组DNA分
30、子的导入；便于筛选克隆子；重组DNA分子在受体细胞内能稳定维持；适于外源基因的高效表达，表达产物的分泌或积累；具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；对遗传密码的应用上无明显偏倚性；遗传性稳定，易于扩大培养或发酵；在理论研究或生产实践上有较高的应用价值。,2.4.2.1 外源DNA转化法：（1）直接转化法 有的微生物细胞在不加任何处理的情况下就能直接摄取外源DNA，只要外源DNA与这样的细胞混合，在适宜的条件下悬浮培养，就能完成外源DNA的转化。（2）化合物诱导转化法 用二价阳离子（Mg2+、Ca2+、Mn2+）处理某些受体细胞，可以使其成为感受态细胞，即处于能摄取外源DNA分子
31、的生理状态的细胞。,（3）接合转化法 接合转化是通过供体细胞同受体细胞间的直接接触而传递外源DNA的方法。该转化系统一般需要三种不同类型的质粒，即接合质粒、辅助质粒和运载质粒（载体）。这三种质粒共存于同一宿主细胞，与受体细胞混合，通过宿主细胞与受体细胞的直接接触，使运载质粒进入受体细胞，并在其中能稳定维持。,（4）微弹轰击转化法 微弹轰击转化法又称基因枪转化法，这是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随金属颗粒进入细胞的转化方法。基因枪法简单快速，可直接处理植物组织，接触面积大，并有较高的转化率。（5）激光微束穿孔转化法 是利用直径很小，能量很高的激光微束照射
32、受体细胞，可导致细胞膜的可逆性穿孔。根据这一原理，在荧光光源进行照射，导致细胞膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞。,（6）超声波处理转化法 超声波处理细胞时可击穿细胞膜并形成过膜通道，使外源DNA进入细胞。超声波处理转化法的转化率较高，并且利用超声波处理可以避免使用电穿孔转化时高电压脉冲对细胞的损伤，有利于细胞存活。（7）脂质体介导转化法 脂质体是由磷脂双分子层组成的人工膜状结构，可以将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或原生质体和吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内，此方法的优点是包在脂质体内的DNA可免受细胞内核酸酶的降解，所以可直接转化外源DNA。,（8）花粉管通道
33、转化法 此方法只用于植物。植物授粉过程中，将外源DNA涂在柱头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。（9）精子介导法 精子介导的基因转移是指精子同外源DNA共浴后再给卵子受精，使外源DNA通过受精过程进入受精卵并整合于受体的基因组中。,（10）磷酸钙转染法 磷酸钙转染法的依据是有的动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。基本操作过程：将待转染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不断搅拌的Hepers-磷酸钙溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀复合物；然后用吸管将沉淀复合物黏附在
34、哺乳动物单层培养细胞的表面上；保温几小时后，用新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养基继续培养，直至外源基因表达。,2.4.2.2 病毒（噬菌体）颗粒转导法用病毒（噬菌体）DNA（或RT-DNA）构建的克隆载体或携带目的基因的克隆载体，在体外包装成病毒（噬菌体）颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组DNA进入受体细胞。,重组子的筛选,7.2组体克隆的筛选与鉴定目前已经发展和应用了一系列构思巧妙，可靠性较高的重组体克隆检测法，包括使用特异性探针的核酸杂交法，免疫化学法，遗传检测法和物理检测法等。遗传检测法根据载体分子表型特征选择生组体分1.子的直接选择法抗药性标记插入失活选择法,2.4.3 克隆子的筛选
35、2.4.3.1 根据载体选择标记基因筛选转化子(1)根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子,(2)根据载体除草剂抗性基因和相应的选择药物筛选转化子由于植物细胞对多数抗生素不敏感,所以常用抗除草剂的蕾作为选择标记基因.基因编码磷化乙酰转移酶(PAT),使转化子对含有磷化麦黄酮(PPT)成分的除草剂具有抗性.,(3)根据lacZ基因互补显色筛选转化子,(4)根据生长调节剂非依赖型筛选转化子这类选择标记基因产物是激素合成必需的酶类,离体培养不含这类选择基因的细胞时,必须添加外源激素,而含有这类选择标记基因的转化子能合成激素,变为激素自养型.因此在培养基中不添加外源激素的情况下,只有转化子才
36、能生长.此类选择标记基因常用于筛选植物转化子.这样的基因如色氨酸单加氧酶基因(iaaM)和吲哚乙酢胺水解酶基因(iaaH),其表达产物可将色氨酸转化为吲哚乙酸.,(5)根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选转化子胸腺核苷激酶基因(tk).二氢叶酸还原酶基因(dhfr),及次黄呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(hgprt),等的表达产物直接参与核苷酸合成代谢.这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡,只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长.如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞,导入含有这些基因的外源DNA,补充原来缺失的基因,使核苷酸合成代谢恢复正常,可以在不添核苷酸的培养基中正常生长.
37、根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子.此方法主要用于筛选动物转化子.,2.4.3.2 根据报告基因筛选转化子作为报告基因,其表达产物应是便于检测,定量和灵敏度高的基因.(1)-葡醛糖酸酶基因(gus)(2)萤火虫荧光素酶基因(luc)gus表达产物萤火虫荧光素酶(LUC)在Mg2+的作用下,可以与荧光素和ATP底物发生反应,形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物,经过氧化脱羧作用后,该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素,可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光,是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因.(3)绿色荧光蛋白基因(gfp)当绿色荧光蛋白暴露于395nm波长的灯
38、光下,便会被激发出绿色荧光,因此可作为报告基因.水母绿色荧光蛋白基因已广泛地用于筛选动植物的转化子.,2.4.3.3 根据形成噬菌斑筛选转化子,2.5 重组子的鉴定2.5.1 根据重组DNA分子特征鉴定重组子.2.5.1.1 根据重组DNA分子大小鉴定重组子,2.5.1.2 根据重组DNA分子限制性内切核酸酶酶切图谱鉴定重组子,2.5.1.3 根据PCR扩增片段鉴定重组子,2.5.1.4 采用DNA杂交法鉴定重组子,2.5.1.5 应用DNA芯片鉴定重组子,2.5.1.6 根据DNA核苷酸序列鉴定重组子 TTCCACTGGA CATAAATCCC CCAAGATTCA TACTTATAAA T
39、ACCCTTGAA AAGAACCAAA GAACCATCCA TCAAGAATGA AGATTACAGG CTATAAATAC ATAGACATCA TGATCCAACT ATCCCCATTG TTGCTACTCC CATTATTCTC AGTATTCAAC TCCATTGCTG ATGCTTCAAC TGAATACCTT AGACCTCAAA TCCATTTAAC CCCAGATCAA GGTTGGATGA ATGATCCGAA TGGGATGTTT TATGATAGGA AAGACAAGTT ATGGCATGTT TATTTCCAAC ATAATCCAGA TAAGAAATCA ATTT
40、GGGCTA CACCTGTCAC TTGGGGTCAT TCCACTTCAA AAGATTTATT AACTTGGGAT TATCACGGTA ATGCATTAGA ACCTGAAAAT GATGATGAAG GTATCTTTTC,2.5.2 根据目的基因转录产物(mRNA)鉴定重组子.,2.5.3 根据目的基因翻译产物(蛋白质、酶、多肽)鉴定2.5.3.1 蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子重组子由于含有外源基因,如果能够正确表达,在总的表达产物中增加了外源基因表达的多肽(蛋白质),所以从重组子中提取的总蛋白质进行凝胶电泳时,电泳图谱上会出现新的蛋白带,根据这一现象就可以初步鉴定是重组子.,2.5
41、.3.2 免疫检测法鉴定重组子(1)酶联免疫吸附法(ELISA),(2)Westhern印迹法,(3)免疫沉淀测定法(immuno-precipitation test),(4)固相放射性免疫测定(RIA)法,细胞工程,3-1 细胞工程基本介绍。细胞工程细胞工程（cell engineering）是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。细胞工程的基本操作(三
42、大技术即无菌操作技术,细胞培养技术,细胞融合技术)。,1 无菌操作技术：就是细胞工程的所有实验却要求无菌条件下进行。对人消毒。对实验室内一切用品消毒。对周围环境保持清洁。2，细胞培养技术：是指动植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。该技术的主要流程是：取材和除菌。细胞培养基的配制（配制灭菌接种）。最佳条件下进行培养（温度，湿度，光照，氧气，CO2）收获或传代。,3，细胞融合技术：就是两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并，染色体等遗传物质重组的过程。细胞融合的技术流程：原生质体的制备（对微生物或植物细胞去除胞壁）。诱导细胞融合常田聚乙二醇（PEG）或电激方法进行细
43、胞融合。原生质体的再生融合后的细胞涂布在某种特殊培养基上，让细胞壁再生。杂合细胞的筛选（把生壁的培养物涂在筛选培养基上，杂合细胞生长，未融合细胞不长。,3-2 植物细胞工程,一.植物组织培养定义：组织培养是在无菌和人为控制外因（营养成分，光，温，湿）条件下培养，研究植物组织器官，甚至从中分化，发育出整体植物的技术。植物组织培养的理论依据就是：植物细胞具全能性。,植物组织培养流程：1预备阶段外植体的选择大小要适宜，选择部位要准确，一般是幼嫩组织和器官，如芽尖或根尖。除菌外植体 自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗 无菌滤低吸干(动画)适宜培养基的配制。2去分化阶段的诱导。外植体是已分化成各
44、种器的切段，故必让这些器官去分化，使各细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，一般在培养基中添加较高浓度的生长素类激素。,3继代增殖：愈伤组织长出后经4-6周的细胞迅速分裂，原有培养基中的水分及营养成分已被耗光，有害代谢物积蓄，必须进行移植，继代。4生根成芽：愈伤组织只有经过就分化才能形成胚状体，继而长成小植株.胚状指的是在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造，通常要将愈伤组织移置于合适是细胞分裂类和生长类的分化培养基中，才能诱导胚状体的生成。光照是本阶段的必备外因。5移栽成活：把长在 人工照明玻璃瓶内的小苗移室外以利于生长此时保证适度的光温，湿度条件。,动画原理,二 植物细胞培养悬
45、浮细胞培养和固定化细胞培养和次生代谢物的生产。植物次生代谢物（plantsecondarymetabolites）是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物.植物次生代谢物种类繁多，化学结构迥异。现在，已知大约有10，000种次生代谢物，包括酚类、黄酮类、香豆素、木脂素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机酸等，可分为酚性化合物、萜烯类化合物、含氮有机物三大类。植物次生代谢物的应用，以医药为例，至今人们依赖于从植物中提取的重要的药物就有五十多种。随着“重返大自然”的呼声日益高涨，人们已认识到：现在是从高等植物的次生代谢产物中去寻找、开发新药的时代。,1 药用植物次生代谢产
46、物药用植物次生代谢产物是指药用植物体内的一大类化合物，它们是细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。不同药用植物的次生代谢产物的合成和积累经常在不同的部位，薄荷属植物次生代谢产物积累在油腺等特殊的结构当中，还有青蒿中的青蒿素的合成和储藏均在腺体特异细胞器中进行。药用植物次生代谢物种类繁多，结构迥异。这些次生代谢产物可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、类萜、甾体及其甙、生物碱七大类。还有人根据次 生产物的生源途径分为酚类化合物、类萜类化合物、含氮化合物（如生物碱）等三大类，据报道每一大类的已知化合物都有数千种甚至数万
47、种以上。,2.药用植物细胞培养技术 在次生代谢产物的生产中，药用植物细胞培养技术是通过给予体外生长的植物细胞一定的营养条件，使其生长，并根据植物或植物不同组织的细胞调节生长 条件来获取所需的次生代谢产物的生物技术。由于植物体内的任何一个细胞都包含有整体植物全部的遗传信息，在一定条件下具有发育成一个完整植株的能力，所以 通过细胞培养技术可得到药用植物的次生代谢产物。用药用植物细胞培养技术生产次生代谢产物有很大潜力。首先次生代谢产物是在完全人工控制的条件下生产的，可一年四季不断进行，不受地区和季节限 制，节约土地，较便于工业化生产。其次，通过改变培养条件和选择优良系的方法可得到超越原植物产量的代谢
48、物，例如通过新疆紫草的细胞培养获得了比原植株含 量高6倍的紫草素。再者，药用植物的细胞培养是在无菌条件下完成的，因此可排除病菌及虫害对药用植物的侵扰。,我们还可以对有效成分的合成路线进行遗传操作，以提高所需的次生代谢产物含量，也可以进行特定的生物转化反应，大规模生产我们所需的有效次生代谢 产物。为了探索新的合成路线和获得新的化合物，可以往组织培养物中加入一种前体，以产生正常情况下原植物所不含的底物，甚至是至今在自然界还没有的化合 物。如植物组织培养选择出来的毛花洋地黄品系能使毛地黄毒苷或其6甲基衍生物在C12位置羟基化而转化成地高辛或6甲基地高辛，通过这种细胞悬浮培 养物的生物转化，能迅速有效
49、地几乎全部转化成更有医药价值的强心剂地高辛。,3.药用植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展到了90年代，国内的药用植物细胞培养技术取得了很大的进展，新疆紫草、人参的细胞培养进入了工业化生产，水母雪莲等进入了中试，其他如黄连、银杏等多种药用植物的细胞培养也十分成功。到目前为止，已经从400多种药用植物中建立了组织和细胞培养物，从中分离出600多种代谢产物。在我国，许多重要药用植物如人参、西洋参、丹 参、紫草、甘草、黄连等的植物细胞培养都十分成功，且人参、新疆紫草细胞培养所达到的技术已接近了国际先进水平。,1 悬浮培养系统：，缺点次生代谢产物积聚少。,2 固定化细胞培养系统：细胞固定化是将细胞包
50、埋在 性支持物的内部或贴付在它的表面。其前提就是通过悬浮培养获得足够数量是细胞。常见的固定化细胞培养系统有两类；平床培养系统：本系统由培养床，贮液缸和蠕动泵构成。缺点：占地面积大。,立柱培养系统：本方法将植物细胞与琼脂或 藻酸钠混合。制成一个个123的细胞团块，并将它们集中于细菌立柱中（扫描70页）,动画原理,三 植物细胞原生质体制备与融合原生质体去除全部细胞壁的细胞。原生质球或球状体是在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体。1 原生质体的制备（取材和除菌酶解分离洗涤鉴定）（用过滤把原生质体和残留组织块和破碎细胞分离）,取材和除菌 原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。但人们往往
