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1、园艺植物生物工程研究所,1,第二章基因工程,园艺植物生物工程研究所,2,基因工程(gene engineering)的概念,基因工程也叫基因操作、遗传工程，或DNA重组技术。是按人们的需要，用类似工程设计的方法将不同来源的基因（DNA分子），在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录、表达的操作。,优点：打破了常规育种难以突破的物种之间的限制。,3,园艺植物生物工程研究所,理论依据,不同基因具有相同的物质基础基因是可切割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代,4,园艺植物生物工程研究所,基因工程的基本过程,
2、它所涉及的过程可用“分(合成)、切、连、转、选、鉴”六个字表示。分(合成)指DNA的制备，包括从生物体中分离或人工合成。切即在体外将DNA进行切割，使之片段化或线性化。连即在体外将不同来源的DNA分子重新连接起来，构建重组DNA分子。转即将重组连接的DNA分子通过一定的方法重新送入或细胞中进行扩增和表达。选从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；鉴就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定,5,园艺植物生物工程研究所,6,基因克隆示意图,园艺植物生物工程研究所,7,第一节 DNA重组技术,园艺植物生物工程研究所,一、DNA的结构与功能,8,园艺植物生物工程研究所,9,脱氧核糖核苷酸分子由脱氧核糖、
3、碱基和磷酸基团（base）组成。,1.组成,园艺植物生物工程研究所,10,多个脱氧核苷酸按此方式连接成多聚脱氧核苷酸，其一端为游离的5磷酸基团(5-P)，称为5端，而另一端为游离的3羟基(3-OH)，称为3端。,园艺植物生物工程研究所,Chargaff规则的内容,所有DNA：A=T、G=C，即A+G=T+C。DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同种的DNA碱基组成不一样。对同一生物物种，DNA的碱基组成没有组织和器官的特异性。DNA的碱基组成不随年龄、营养状况及环境的改变而改变。,11,园艺植物生物工程研究所,2.结构,（1）DNA的一级结构脱氧核苷酸在长链上的排列顺序就是DNA的一级结构。不
4、同种DNA之间的千差万别只是在碱基排列顺序不同。DNA的一级结构也称为核苷酸序列或碱基序列。,12,园艺植物生物工程研究所,（2）DNA的二级结构,DNA的二级结构即DNA双螺旋结构模型(DNA Double Helix Model).,13,园艺植物生物工程研究所,14,DNA的高质量 X射线衍射图,园艺植物生物工程研究所,15,1953.Watson&Crick,B-DNA的右手双螺旋模型,园艺植物生物工程研究所,16,DNA双螺旋的结构特点,l 两股单链糖-磷酸构成骨架，居双螺旋外侧。碱基位于双螺旋内侧，并与中心轴垂直。,l每圈螺旋含10个核苷酸残基，螺距：3.4nm,直径:2nm。有两
5、个沟：大沟和小沟。,l 碱基严格配对:A与T、C与G互补碱基与互补链。,l 由两条反向平行的脱氧多核苷酸链围绕同一中心轴构成右手双螺旋结构。,园艺植物生物工程研究所,17,影响双螺旋结构稳定性的因素,氢键(Hydrogen bond)弱键,可加热解链.磷酸酯键(phosphoester bond),也叫离子键。强键,需酶促解链.碱基堆积力(非特异性结合力).磷酸骨架,氨基,酮基周围水分子间的有序排列 Van de waals force 疏水作用力(Hydrophobic interaction),园艺植物生物工程研究所,18,DNA的分子构型（B/Z/A）比较,19,由于双链DNA是靠互补配
6、对的碱基之间的氢键维持的，因此当溶解在溶液中的双链 DNA处于较高温度条件下时，因氢键断开而解链成单链DNA，此过程称为DNA变性。DNA溶液加热到90时，就足以使DNA完全变性。高温变性的DNA被逐渐冷却时，分开的两条单链又会重新结合成双链DNA，此过程称为复性。,园艺植物生物工程研究所,DNA的变性与复性,20,园艺植物生物工程研究所,DNA的变性与复性,DNA分子杂交,21,园艺植物生物工程研究所,双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalently closed circle,CCC)分子，这种双螺旋环状分子
7、再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。,22,园艺植物生物工程研究所,（3）DNA的三级结构,23,园艺植物生物工程研究所,（1）DNA分子能在细胞内复制,以亲代DNA的一条单链为模板，按照碱基互补原则，合成另一条具有互补碱基的新链。通过复制所形成的新DNA子链，含有原来亲本DNA双链分子的一条亲代链和一 条新的子代链，所以DNA这种自我复制方式称为半保留复制。,园艺植物生物工程研究所,24,3.DNA的功能,25,园艺植物生物工程研究所,园艺植物生物工程研究所,26,DNA的功能起着贮存和传递遗传信息的作用。基因基因就
8、是DNA的功能片断，或者说基因是一段DNA顺序。,（2）贮存和传递遗传信息,DNA的基本功能就是作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础。,27,园艺植物生物工程研究所,DNA体外重组，首先必须获得重组和能够重组的DNA片段。如何获得DNA片段呢？,28,二、限制性内切酶与DNA片段化,园艺植物生物工程研究所,29,一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖,园艺植物生物工程研究所,30,园艺植物生物工程研究所,31,限制性内切酶(restrictio
9、n endonuclease)是指一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适反应条件下使每一条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH基团和5-P基团的DNA片段。内切核酸酶有型酶、型酶和型酶。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50l体积1小时内完全切开1g 噬菌体DNA所需的酶量。,1.限制性内切酶,园艺植物生物工程研究所,32,限制性内切酶的种类,园艺植物生物工程研究所,（1）限制性核酸内切酶的命名,一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。前三个字母必须是斜体。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取
10、的限制性内切酶称为Bam H。在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboII等。EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序)。EcoR I Escharichia coli Ry13 first,33,园艺植物生物工程研究所,（2）识别序列,限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为6个核苷酸的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。少数限制性内切酶的识别序列由4个或者5个核苷酸对组成。,34,
11、园艺植物生物工程研究所,35,园艺植物生物工程研究所,（3）酶切位点,36,DNA在限制性内切核酸酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为酶切位点，可用表示。一般酶切位点在识别序列内部，如GGATCC；少数在识别序列两侧，如：GATC、CATG等。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段；另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即黏端）的DNA片段,园艺植物生物工程研究所,平末端与黏性末端,37,园艺植物生物工程研究所,38,39,反应只需Mg2+的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一
12、个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多型酶切割DNA后，可在DNA上形成黏性末端，有利于DNA片段的重组。,II型酶,40,园艺植物生物工程研究所,41,类酶识别序列特点,同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶Hpa和Msp是一对同裂酶（CCGG)，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时Hpa不能进行切割，而Msp可以。,同裂酶与同尾酶,42,园艺植物生物工程研究所,同尾酶（isocaudamer）,43,序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。
13、利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。,园艺植物生物工程研究所,三、特异DNA片段的PCR扩增,PCR 技术(Polymerase Chain Reaction):是在模板DNA、引物和四种dNTP 等存在的条件下,依赖于DNA 聚合酶(Taq 酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步:变性、退火、延伸。以上三步为一个循环,经25 30次循环DNA 数量可达210 6 7拷贝数。,44,园艺植物生物工程研究所,45,PCR技术的发明,园艺植物生物工程研究所,46,Kary B.Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mulli
14、s荣获1993年度诺贝尔化学奖。,园艺植物生物工程研究所,PCR技术的反应条件,标准的PCR反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L,47,园艺植物生物工程研究所,48,园艺植物生物工程研究所,49,反应初期，目的DNA片段呈指数形式增加；随着目的DNA的积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和平台期（25个循环）。,50,园艺植物生物工程研究所,1.双链DNA变性,51,（一）PCR的反应过程,园艺植物生物工程研究所,52,2.引物与模板DNA退火,园
15、艺植物生物工程研究所,53,3.引物延伸 DNA合成,园艺植物生物工程研究所,54,4.第二轮循环的变性,园艺植物生物工程研究所,55,5.第二轮循环的引物延伸 DNA合成,园艺植物生物工程研究所,56,园艺植物生物工程研究所,57,PCR反应的特点,特异性强灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(mg=10-6)水平简便、快速：PCR反应一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。,园艺
16、植物生物工程研究所,58,（二）RT-PCR（reverse transcription PCR）,反转录PCR是一种从RNA扩增cDNA的方法。提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA；再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。,园艺植物生物工程研究所,59,60,四 DNA片段的化学合成,利用DNA合成仪，根据待合成的DNA片段预定的核苷酸序列，可自动的将4种核苷酸单体按3-5磷酸酯键连接成寡核苷酸片段。合成引物合成DNA寡核苷酸连杆(linker)合成基因片段,园艺植物生物工程研究所,寡核苷酸
17、连杆,也称为衔接物或接头，是一种按预先设计，化学合成的寡核苷酸片段。有一种或几种限制性内切核酸酶的识别序列，使连接了寡核苷酸连杆的DNA片段经过这些限制性内切核酸酶酶切后，可以产生一定的黏性末端，便于与具有相同黏性末端的另一DNA片段连接。,61,园艺植物生物工程研究所,有的寡核苷酸连杆超过100个核苷酸，其上有多种限制性内切核酸酶识别序列，不仅可作为连杆，而且被组装在克隆载体上成为多克隆位点(MCS)。这样的连杆被称为多克隆位点核苷酸连杆或简称MCS连杆。,62,园艺植物生物工程研究所,MCS连杆,五 DNA片段的连接重组,DNA连接酶(DNA ligase)能催化双链DNA片段紧靠在一起的
18、3-OH末端和5-P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前用于试管中连接DNA片段的DNA连接酶E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。E.coli DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接；而T4 DNA连接酶既可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接。,园艺植物生物工程研究所,63,1.DNA连接酶,64,DNA连接酶只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。,园艺植物生物工程研究所,65,DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。
19、DNA连接酶 NAD+T4 DNA连接酶 ATP,（1）具互补黏性末端片段之间的连接连接反应可用E.coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶；待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性内切核酸酶酶切的，连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。如果是用两种同尾酶酶切的，虽然产生相同的互补黏性末端，可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子往往消失了原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列。,66,2.DNA片段之间的连接,园艺植物生物工程研究所,Bam H切割反应,DNA连接酶,+,2.DNA片段之间的连接,（1）具互补黏性末端片段之间的连接,（2）具平末端DNA片段之间
20、的连接,采用核酸外切酶将黏性末端修饰成平末端；采用末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）将平末端修饰成互补黏性末端。,69,（3）DNA片段末端修饰后进行连接,园艺植物生物工程研究所,人工合成的连杆或衔接头先将连杆连接到待连接的一种或两种DNA 片段的末端，然后用合适的限制性内切核酸酶酶切连杆，使待连接的两种DNA片段具互补黏性末端，最后在DNA连接酶催化下使两种DNA片段连接，产生重组DNA 分子。,70,（4）DNA 片段加连杆后连接,园艺植物生物工程研究所,71,衔接物连接法,园艺植物生物工程研究所,3.DNA重组类型DNA重组实际上是两种DNA片段的连接，若待连接的两种DNA片段各含有
21、一个以上的基因，这样的DNA重组也称为基因重组。DNA 重组分为插入重组和置换重组。,72,园艺植物生物工程研究所,（1）插入重组 待重组的外源DNA片段的两端具有相同末端，而接受外源DNA片段的DNA分子用某种限制性内切核酸酶酶切后产生的末端与外源DNA片段的末端相同，并且这种限制性内切核酸酶在此DNA分子上只有一个识别序列。因此，两者用某种限制性内切核酸酶酶切后连接产生的重组DNA分子，外源DNA片段插入到另一DNA分子之中，因此称为插入重组。,73,园艺植物生物工程研究所,（2）置换重组待重组的外源DNA片段的两端具有相同末端，对于接受外源DNA片段的DNA分子来说，部分序列已被外源DNA片段置换。,74,园艺植物生物工程研究所,园艺植物生物工程研究所,Thank you for your attention!,75,
