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1、Chapter 5 The immobile of Enzyme，Cell and Protoplast,酶、细胞、原生质体固定化,游离酶的缺点,酶的稳定性差，易受外界因素影响而失活酶不易回收利用（酶的一次性使用）产物不易分纯，且难连续化生产酶的催化效率不够高,Contents of chapter 5,概述第一节 酶固定化第二节 细胞固定化第三节 原生质体固定化,2.什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水溶性酶,活化基团,固定化酶,酶的固定化,固定化酶概念,指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。通过吸附、偶联、交联、包埋等物理或化学的方法制备成的具有催化活性的水不溶性
2、酶。,2.固定化酶的制备方法,吸附法,离子键结合法共价键结合法交联法,凝胶包埋法半透膜包埋法,固定化方法,非共价结合法,化学结合法,包埋法,热处理法,吸附法,1.吸附作用力2.固体吸附剂包括活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石3.优缺点,（3）包埋法,将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。只适合作用于小分子底物和产物的酶。,凝胶包埋法（网格型）半透膜包埋法（微囊型）,包埋法,1）凝胶包埋法（网格型）,将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。,首先被采用的网格包埋法是：固定化胰蛋白酶
3、木瓜蛋白酶 淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙稀酰胺,丙稀酰胺引发剂inactiation,2）半透膜包埋法（微囊型）,将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方法。,界面聚合法,是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。,（3）结合法,1）共价结合法 通过共价键将酶与载体结合的方法。,结合方法.将载体有关基团活化，然后将酶有关基因发生偶联反应；,与载体共价结合的酶的功能基团-氨基，-氨基，,或位的羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。,载体,天然有机载体（多糖、蛋白质、细胞等）,无机物（玻璃、陶瓷等）,合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙
4、等）,优缺点,.优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。.缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂；酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力降低。,载体活化方法,A重氮法B叠氮法C烷基化反应法D溴化氰法,A重氮法,反应示意式,NaNO2/HCl,酶-Tyr,重氮盐衍生物,载体,固定化酶,A重氮法,将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进活泼的重氮基团。载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应而制得固定化酶。,B.叠氮法,反应示意式,CH3OH/HCl,NH2NH2（肼）,NaNO2/HCl,酶-NH2,B.叠氮法,对含有羧
5、基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联。,C烷基化反应法,含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化反应，制备成固定化酶。,酶,D溴化氰法,本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类（含有羟基）物质（如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数），生成亚氨基碳酸衍生物。,D 溴化氰法,亚氨基碳酸基团在微碱性条件下，可与酶分子上的氨基反应，制成固定化酶。,D 溴化氰法,用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。,共价
6、结合法中载体的活化方法,重氮法叠氮法烷基化法溴化氰法,含有苯氨基（亚硝酸）,含有酰肼基/羧基（亚硝酸）,含有羟基（三氯三嗪等多卤代物）,含有羟基（溴化氰活化）,2）交联法,借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱（shiff）。第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶。,（4）热处理法,将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶稳定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处
7、理法只适用于热稳定性较好的酶的固定化，在热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。,下表是某酶的纯化总结表，试计算比活力，回收率及纯化倍数。,2736.9,13080.2,23314.5,140726.7,1,4.8,8.5,51.4,100,30,10,9,实验 木瓜蛋白酶的固定化,实验原理：载体：尼龙固定化方法：共价结合法尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。,实验 木瓜蛋白酶的固定化,酶的固定化步
8、骤：（1）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出后用水冲去污物，用吸水纸吸干。（2）将尼龙布用3.65mol/L HCl溶液在室温下水解45min，用水洗至pH值中性。（3）将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。,实验 木瓜蛋白酶的固定化,酶的固定化步骤：（4）取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.51mg/mL）在4下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。（5）从酶液中取出尼龙布（保留残余酶
9、液作测定用），用0.5mol/L NaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。,实验 木瓜蛋白酶的固定化,酶活力测定：（1）溶液酶活力测定：取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，于37下预热10min，加入37预热的0.5%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，然后加入10%三氯乙酸溶液2.0mL终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定管相同，以4000r/min的转速离心5min或过滤，取其上清液于波长280nm处测定消光值。在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为1个酶单位(U)(以下同)。
10、,实验 木瓜蛋白酶的固定化,酶活力测定：（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。,实验 木瓜蛋白酶的固定化,结果计算：固定化酶总活力活力回收=100%溶液酶总活力 固定化酶总活力数相对活力=100%溶液酶总活力数-残留酶活力数,3.固定化酶的性质,（1）固定化后酶活力的变化酶活力降低，反应速度下降原因：1）构象改变：酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸。2）空间位阻：固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用。3）内扩散作用
11、：内扩散阻力使底物分子于活性中心的接近受阻。4）立体障碍：包埋时酶被高分子物质包埋，大分子不能透过膜与酶接近。,（2）固定化酶的稳定性大多提高,1）稳定性大多提高热稳定性大多提高，有些反而下降对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高对不同pH（酸度）稳定性，对分解酶的稳定性、贮存稳定性和操作稳定性提高。2）稳定性提高的原因固定化后，酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形；酶活力的缓慢释放；抑制自降解，提高了酶稳定性。,青霉素酰化酶：固定化酶在pH5.510.3稳定，游离酶仅在pH7.09.0稳定。,（3）固定化酶的最适温度变化可能提高,固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能变化也不大
12、，有些会发生变化；由于固定化，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高；固定化酶的最适作用温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响。,（4）固定化酶的最适pH发生改变,酶经固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移；2）载体性质对最适pH的影响；一般用带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH。一般用带正电荷载体（阳离子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH。,1）pH对酶活性的影响：改变酶的空间构象影响酶的催化基团的解离影响酶的结合基团的解离改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。,3）产物性质对最适pH的影响；产物酸性，其最适pH。产物碱性，其
13、最适pH。产物中性，其最适pH不变。,（5）底物特异性发生改变,对作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化；对于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。,（6）固定化酶的米氏常数（Km）发生改变,当酶结合于电中性载体时，由于扩散限制，造成表观Km；由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。当载体与底物电荷相反，固定化酶的表观Km；当载体与底物电荷相同，固定化酶的表观Km显著增加。Km值又受载体的疏水性及溶液中离子强度的影响。,改变,可能改变,发生变化,固定
14、化酶的性质,固定化酶活力固定化酶的稳定性固定化酶的最适温度固定化酶的最适pH固定化酶的底物特异性固定化酶的米氏常数（Km）,活力降低,大多提高,可能提高,载体性质带负电荷：固定化酶pH带正电荷：固定化酶pH产物性质产物酸性：固定化酶pH产物碱性：固定化酶pH产物中性：固定化酶pH不变,作用于小分子底物的酶不变可作用于小分子及大分子底物的酶改变,载体与底物电荷相反Km降低载体与底物电荷相同Km升高,5.4 细胞和原生质体固定化,1、细胞固定化细胞的固定化：通过各种方法将细胞与水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程。固定化细胞：指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理、化学等因素的约束或限制在一定的
15、空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能反复或连续适用的活力。,（1）固定化细胞的分类,按细胞类型分类固定化微生物细胞固定化植物细胞固定化动物细胞按生理状态分固定化死细胞固定化活细胞固定化静止细胞和饥饿细胞固定化生长细胞（增殖细胞）,：完整细胞、细胞碎片、细胞器,：较适合于单酶反应,：更适合于多酶反应,（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点,优点.有利于提高细胞的存活率和稳定性；.缩短发酵周期，提高生产能力（产率）；.提高发酵稳定性，可在较长时间内反复和连续使用；.易与培养液与产物分开，利于产品的分离纯化，提高产品质量。,（2）固定化（增殖）细胞的优点和缺点,缺点.利用的仅是胞内酶，副产物多；.
16、细胞膜、细胞壁及载体存在扩散限制作用；.载体形成的孔隙大小影响高分子底物和产物的通透性。,（3）固定化细胞的制备（P169-178）,一般说，对于一步和两步反应的转化过程，用固定化酶较合适；对多步转化，采用整体细胞有利。,固定方法,吸附法,包埋法,：制备固定化细胞的主要方法。,：凝胶包埋法是应用最广泛的方法。,琼脂凝胶包埋法海藻酸钙凝胶包埋法角叉菜胶包埋法明胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法光交联树脂包埋法,研究热点光交联树脂包埋法,例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用
17、紫外照射3min，就可制得。,活性炭固定化产脂肪酶的发酵性丝孢酵母细胞的研究,摘要：以活性碳为载体，采用吸附培养的方法将发酵性丝孢酵母细胞固定化，确定了吸附培养固定化的适宜条件，并测定了固定化细胞的保存稳定性和使用稳定性。结果表明，在100mL发酵培养基中(250mL摇瓶)添加1.0 g活性碳于30、160 r/min吸附培养48h，可吸附较多细胞。将固定化细胞于40保存30 d脂肪酶活力无明显下降。用固定化细胞催化人豆油转酯化反应，连续催化5批后酯化率仍超过50。,载体的预处理,将一定量活性炭颗粒置于lmol/L HCl溶液中，于50搅拌1h后除去酸液，用去离子水反复冲洗至洗液pH值为中性，
18、然后于130烘干待用。,固定化细胞的吸附培养与处理,在l00mL发酵培养基中(250mL摇瓶)加入一定量经预处理的载体，接入10的液体种子，于30、160r/min摇床发酵，滤出载体，用去离子水和50mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)洗涤3次，风干制得固定化细胞。,固定化细胞的保存稳定性,将固定化细胞置于4保存，定期取样测定胞内脂肪酶活力，以游离细胞作对照旧。,固定化细胞的使用稳定性,用固定化细胞催化大豆油进行转酯化反应，每反应一批后，回收固定化细胞，用丙酮充分洗涤，风干，加入新的反应体系中，继续进行转酯化反应。,5.4 细胞和原生质体固定化,2.原生质体的固定化（1）原生质体的制备1）制
19、备过程 将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中加入水解酶分离得到原生质体2）细胞壁水解酶细菌：溶菌酶酵母菌：蜗牛消化酶霉菌：几丁质酶植物：纤维素酶，果胶酶,（2）原生质体固定化 将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。,（3）固定化原生质体的特点,1）增加细胞的通透性，利于氧气及营养物质的传递和吸收，利于胞内产物的释放，可显著提高产率。2）有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用或连续使用较长时间，利于连续化生产。3）易与发酵产物分开，有利于产物的分
20、离纯化，提高产品质量。4）固定化原生质体发酵的培养基中需添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性。,辅酶、细胞及原生质体的固定化方法,辅酶多采用共价结合法细胞吸附法凝胶包埋法原生质体包埋法,上节课主要内容,固定化酶的性质辅酶的固定化细胞及原生质体的固定化,改变,可能改变,发生变化,固定化酶的性质,固定化酶活力固定化酶的稳定性固定化酶的最适温度固定化酶的最适pH固定化酶的底物特异性固定化酶的米氏常数（Km）,活力降低,大多提高,可能提高,载体性质带负电荷：固定化酶pH带正电荷：固定化酶pH产物性质产物酸性：固定化酶pH产物碱性：固定化酶pH产物中性：固定化酶pH不变,作用于小分子底物的酶不变可作
21、用于小分子及大分子底物的酶改变,载体与底物电荷相反Km降低载体与底物电荷相同Km升高,辅酶、细胞及原生质体的固定化方法,辅酶多采用共价结合法细胞吸附法凝胶包埋法原生质体包埋法,评价固定化酶（细胞）的指标,1、固定化酶（细胞）的活力2、偶联率及相对活力3、固定化酶（细胞）的半衰期,5.5 固定化酶（细胞）的应用,固定化酶在基础理论研究中应用固定化酶和亲和色谱固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在分析化学中应用固定化酶与环境保护固定化酶在新能源开发中的应用,1.在基础理论研究中的应用（1）阐明酶反应的机理在多酶反应中，将酶固定化后装成酶柱，说明每一个酶的作用。（2
22、）酶亚基性质的研究采用固定化方法，控制一定的条件，使多亚基酶中只有一个亚基与载体相连，再通过一定的方法，除去未被固定的亚基，从而研究单亚基的性质。,活化载体,载 体,+,活化,+,例如：醛缩酶亚基活力的测定,8mol/L尿素,透析,醛缩酶亚基活力测定,（3）揭示酶原激活机理有时酶原激活并不涉及蛋白水解。如：酪氨酸酶，固定化后，不需水解就可活化至天然酶活的2030。说明蛋白酶结构重排后可激活酶的一些活力。（4）研究蛋白质-核酸分子结构如：用双功能试剂测定酶侧链基团之间的距离；用交联法分析寡聚蛋白的四级结构。,2.亲和分离系统,（1）生物亲和技术的基础：生物活性化合物特异性信息的综合。（2）亲和分
23、离 利用生命现象中生物分子间特有的高亲和力、高专一性，可逆结合而设计的一种十分巧妙的纯化方法，是唯一的一种能够体现待分离物质间生物学功能差异的分离方法。,（3）亲和分离种类1）将某种作为配基的生物分子偶联于固相载体上制成亲和吸附剂，用作色谱的填充剂来分离与之特异结合的配体，然后将配体洗脱下来并回收-亲和色谱法。2）将配基偶联于载体上，用于选择性地去除某些污染物。3）将细胞表面抗原分子对应的抗体偶联于载体上用于细胞的标记、分离及性质研究。,（4）应用1）物质分离2）微量物质的分析3）肽库及抗体库的筛选4）制药工业（亲和色谱用于药用重组蛋白的纯化）5）核酸分离（碱基配对）,色谱固定化金属离子亲和色
24、谱法纯化猪铜锌超氧化物歧化酶,以Cu+-Sepharose 4B固定化金属离子亲和色谱法纯化猪铜锌超氧化物歧化酶，考察丁不同的洗脱缓冲溶液及其pH 对纯化效率的影响，显示了方法的有效性。,色谱固定化铜离子亲和膜色谱柱吸附血红蛋白的研究,将纤维素滤纸进行碱处理及环氧活化、偶联亚氨基二乙酸、固定化铜离子等处理，并将其装入自制的色谱柱管，制得固定化铜离子亲和膜色谱柱。该柱可用于吸附血红蛋白(hemoglobin，Hb)，吸附率可达到90以上。,3.药物控释载体,从时间和空间分布上控制药物的释放。（1）一些药物不能用于临床的原因1）很多药物尤其是蛋白质类药物，口服易被胃酸破坏或沉淀。2）单纯注射后瞬时
25、血药浓度提高，但马上被肝脏及血液中的酶系统所消除，需要反复注射，不仅增加治疗费用，而且增加感染的机会。3）肿瘤化疗用细胞毒性物质选择性较差，全身毒副作用严重。4）有些药物亲水性强，难于穿过细胞膜。5）蛋白质类药物易引起免疫反应。6）很多药物稳定性差，不耐贮存。,药物控制释放技术：将药物或其他的活性物质与适当的载体按一定的形式制成制剂，控制药物在人体内吸收、代谢以及排泄的过程。使药物按设计的剂量，在要求的时间范围内以一定的模式在体内释放或使药物在指定部位释放而达到治疗某种疾病的目的。,（2）解决方法,1）聚合物修饰 多用于蛋白质类药物。这类药物生物半衰期短，免疫性强，可用适当的水溶性高分子聚合物
26、加以修饰以改善其性能。2）凝胶包埋 希望药物能够较长时间内维持一个稳定浓度 用生物相容性好的高分子聚合物与药物混合制成含有药物的凝胶，植入人体内特定部位，以达到缓释给药效果。,3）微球制剂,用高聚物微球包埋或化学偶联药物可制成微球制剂，它具有靶向性、缓释性及减少抗药性等特点。微球与靶细胞接触，可以通过胞饮进入胞内发生作用，不影响细胞膜通透性，不会产生抗药性。4）脂质体 脂质体是磷脂双分子层在水溶液中自发形成的超微型中空小泡，具有靶向性、长效性。并且可以通过胞饮作用胞内释放药物，从而避免抗药性；此外还具有更好的生物相容性和可生物降解性，并且无毒性，无免疫原性。,5）导向药物,导向药物具有主动靶向
27、性，将针对肿瘤细胞的单克隆抗体与化疗药物化学偶联，可以直接作用于肿瘤细胞而产生杀伤作用，并且降低全身毒性。,高分子通报生物可降解聚酯用作蛋白质药物控释载体,聚乳酸PLA及乳酸与羟基乙酸的共聚物PLGA，由于其良好的生物相容性以及生物降解性，可用作蛋白质类药物控释体系的载体材料，同时可延长蛋白质药物的释放。本文综述了几种生物相容性聚酯及其衍生物以及它们的形成方法：(1)在PLGA的分子链中引入亲水性的含醚键的分子如PEO、PEG，来提高聚合物的亲水性，形成PLGA嵌段共聚物；(2)将细胞可接受的片段或多肽固定在聚合物支架表面，来增强PLGA与细胞间的粘附力，得到靶向的PLGA衍生物；(3)改变P
28、LGA载体内的酸性环境，提高蛋白质药物在载体中的稳定性，发展了支化聚酯PVA-g-PLGA，并得到均速的药物释放。以上这些方法所得到的聚酯及其衍生物，均可作为蛋白质类药物安全、可靠的载体材料。,4.生物传感器,由固定化酶（或细胞、细胞器等）与适当的换能器（电极、场效应管、离子选择场效应管等）密切结合而构成的分析系统，由感受器、换能器和电子线路三部分组成。应用：葡萄糖氧化酶电极，青霉素酶电极,Pellinen等研究了一种发光的大肠杆菌(Escherichia coli K12)用于测量鱼肉样品中四环素等抗菌素的含量。该生物传感器是将一种带荧光素酶操纵子的质粒导人大肠杆菌中，可检测鱼肉中的四环素和
29、土霉素的浓度，测量极限分别为20 ng kg-1 和50 ng kg-1。,5.其他方面的应用（P165-169，172-174，176，178，181）,（1）工业催化剂（2）工程菌的培养（3）化学分析和临床诊断（4）临床治疗（5）环境中微量有毒物质的含量测定，进行环境监测（6）新化学能源的开发,固定化酶在工农业生产上的应用,固定化酶在医药治疗上的应用,例：制造人工肾利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。,固定化生长菌体在三废处理上的应用,新能源开发中的应用,H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生H2，但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢，稳定性比天然细胞好。将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶原膜包被，可用于水的光介产生氢气和氧气。,小 结,固定化酶（细胞、原生质体）的定义固定化酶（细胞、原生质体）的方法固定化酶的性质固定化酶（细胞、原生质体）的应用,思考题,一、简答题1、简述常用的固定化方法及其应用范围。2、何谓固定化酶？固定化酶的特性与游离酶比较有哪些改变？3、举例说明固定化酶在工业生产上的应用。4、何谓固定化细胞？固定化细胞有何特点和应用？5、简述固定化原生质体的制备方法与特点。二、综合分析题1、试分析固定化酶与固定化细胞的异同。2、固定化细胞与固定化原生质体有哪些异同点？,
