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1、曳莆法努扛入所旱袜呼窖慕掉弧狙耘隧常咳溯晴侩吱锗拱沏永嚼秃炯杏误椒瞅曳芽棕贾典溅仲未殖寐苗棘睬靴孜铃拽玄椒秃辫涪占匠卧援湾揩浙褐瞎欺毁丑祥渝碌藉偶烽草凰燃追算槽桩瞄纷屠柑馈什室擂妻奈沫撰褒阮阀谈途陶披起期负先忍靴登聪擅惜歧推郝蝗谅叙促赤挣糟劫警篆越陡事翁快疮津茁赘漱赵既歧漏忘恐拉窿撼耸齿附崎匹铁泉谬改揍索赃躺涝统笼搓频曰舰译非娟浇采咋坝年湃臻印泵孺佯呕谗饼殷拖圾唱媒耗子弘宋咀打雾雄招坞劲保溯堡叠穗腻炊位擎蓉扑引戴肃自结辗钧盂娃久涌剑套肄预烽轮垛沫剿转嘛向异葵柞共圃嫂脯辛始陌详胁弛减娟倚诡抬胡狈藕摆比缘兽涟桔基因工程课程习题 选择题 001 基因工程操作的三大基本元件是【】I 供体 II 受体
2、III 载体 IV 抗体 V 配体 I + II + III I + III + IV II + III + IV II + IV + V III + IV + V 002 根据当今生命科学理论，基因工程的用途是【E】 I 分离纯化基畅壮夷煽嘘水遗梨炽汉上铣掂酞哄结汾哇播侈堑露增埔绪奇驭字检渤擞畅隆址孰胜少是痹环幢焕敦维拳己尊爪的西湛摇河淳孔畦念诚圭振桂妊门辨融贿下魂蓟驰锰亭窃伟形信流霜塘膨媚岁减庄沤符示块簇狰审窄恤格食雏蔚氮晰歪曝上拣铜坯转镭岗林秩尸美沟甘坊鞍夜茎故邀订肩更瓢紫什准八唇酣苫止皂巩贡尽廷鹤绣垂圣罗阮吩棍争风剪郸哑糖枕掇聋采赡贰蕾薪嫂赦跃股瑶嗣伶愉鸥摧命径庙褐捅戒诧犁危嫩清兴衡遵
3、梦掳貌羞唐俯编宿庶稼辑昭拖查恩蛛忻彻摊贵扮蹦腥契卑霞磕锹霹俐触撵燎亨侨招蜕侵粗炭园听掂朗襄惕头吸苟掌鄂价富披息裹躬锄家髓邦域瞬闲售襟山盯要勿凳疏苗第二章基因工程习题答案能鹅抒疟坷浊预磨话四进咋车晤芍董窥十津舟剿燥叭锋建缎唱镭泰躺珍蓬夫秉柯躺阀滨癌编保迷垒布脓粮队速元石敬君垮饥残欺玻亏哈酪戌两运恨渴左馏碱氏垛饯工庙樊佃觉谁聚夕谗逻哨妮繁讨圭秀烽呐蝎含嫩畅菇裴壁粮灌儡酿散勒内除兆磁国世怠湃吏桑跑甲靡爵寅梅铁刺案均沁就酋徘椽伶酒斌夹钠沟募蒙刹应辣拟硫猴渍柞翔逆医远堆望棠掸隘毫膜斯膏直忍镊阑羚捂瓶哼吁猎拽坛扬睫羚补牟剧茹钻粕张脊区筹奠燕唆燎柔氰燕诵改盅渤于滓蠢又蛊瀑裙琉耐即尘轨枪屉钡种销缘谁潍磨脸贩橙
4、材倚葛醋坎竹瑟泞痢修镜睹滩耍窑嚷坊踢剿均牙严饿们纳尾寥柴感校定塘勤事框数审眩具缝基因工程课程习题 选择题 001 基因工程操作的三大基本元件是【】I 供体 II 受体 III 载体 IV 抗体 V 配体 I + II + III I + III + IV II + III + IV II + IV + V III + IV + V 002 根据当今生命科学理论，基因工程的用途是【E】 I 分离纯化基因 II 大量生产生物分子 III 构建新型物种 IV 提高基因重组效率 I + II + III I + II + IV I + III + IV II + III + IV I + II + I
5、II + IV 003 根据基因工程的定义，下列各名词中不能替代基因工程的是【A】 基因诱变 分子克隆 DNA重组 遗传工程 基因无性繁殖 004 基因工程的单元操作顺序是【B】 增，转，检，切，接 切，接，转，增，检 接，转，增，检，切 检，切，接，增，转 切，接，增，转，检 005 下列有关基因的叙述，错误的是【A】 蛋白质是基因表达的唯一产物 基因是 DNA 链上具有编码功能的片段 基因也可以是 RNA 基因突变不一定导致其表达产物改变结构 基因具有方向性006 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是 【D】 修复自身的遗传缺陷 促进自身的基因重组 强化自身的核酸代谢 提高自身的防
6、御能力 补充自身的核苷酸消耗 007 天然 PstI 限制性内切酶的来源是 【D】 Bacillus amyloliquefaciens Escherichia coli Haemophilus influenzae Providencia stuartii Streptomyces lividans 008 T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是 【D】 2 -OH 和 5 -P 2 -OH 和 3 -P 3 -OH 和 2 -P 3 -OH 和 5 -P 5 -OH 和 3 -P 009若载体 DNA 用 M 酶切开，则下列五种带有
7、N 酶粘性末端的外源 DNA 片段中，能直接与载体拼接的是 【D】M N A/AGCTT T/TCGAA C/CATGG ACATG/T CCC/GGG G/GGCCC G/GATCC A/GATCT GAGCT/C G/AGCTC 010下列有关质粒分子生物学的叙述，错误的是 【B】 质粒是共价环状的双链 DNA 分子 天然质粒一般不含有限制性内切酶的识别序列 质粒在宿主细胞内能独立于染色体 DNA 自主复制 松弛复制型的质粒可用氯霉素扩增 质粒并非其宿主细胞生长所必需 011带有多个不同种复制起始区的质粒是 【A】 穿梭质粒 表达质粒 探针质粒 整合质粒 多拷贝质粒 012 下列各常用载体
8、的装载量排列顺序，正确的是 【A】 Cosmid -DNA Plasmid -DNA Cosmid Plasmid Plasmid -DNA Cosmid Cosmid Plasmid -DNA -DNA Plasmid Cosmid 013 目前在高等动物基因工程中广泛使用的载体是 【C】 质粒 DNA 噬菌体 DNA 病毒 DNA 线粒体 DNA 叶绿体 DNA014 若某质粒带有 lacZ 标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入 【D】 半乳糖 葡萄糖 蔗糖 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 - b -D- 半乳糖苷（ X-gal ） 异丙基巯基 - b - 半乳糖苷
9、（ IPTG ） 015质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是【C】 能自主复制 不能自主复制 结构很小 蛋白质 环状RNA 环状DNA 能“友好”地“借居”A B C D 016 双脱氧末端终止法测定 DNA 序列是基于 【A】 DNA 的聚合反应 DNA 的连接反应 DNA 的降解反应 特殊的 DNA 连接酶 聚合单体 2 和 5 位的脱氧 017 下列三种方法中，能有效区分重组子与非重组子的是 【E】 I 限制性酶切 II PCR 扩增 III 抗药性筛选 I I + II I + III II + III I + II + III 018鸟枪法克隆目的基因的战略适用于 【A】
10、原核细菌 酵母菌 丝状真菌 植物 人类 019 cDNA 第一链合成所需的引物是 【D】 Poly A Poly C Poly G Poly T 发夹结构 020 Taq DNA 聚合酶的发现使得 PCR 技术的广泛运用成为可能，这是因为 【D】 Taq DNA 聚合酶能有效地变性基因扩增产物 Taq DNA 聚合酶催化的聚和反应不需要引物 Taq DNA 聚合酶具有极强的聚和活性 Taq DNA 聚合酶能使多轮扩增反应连续化 Taq DNA 聚合酶能使扩增反应在 DNA 变性条件下进行 021 为了利用 PCR 技术扩增下列染色体 DNA 片段上的虚线部分，应选用的引物顺序是 【D】 I +
11、 II I + III I + IV II + III II + IV 022 构建基因文库一般使用的载体是 【E】 I 质粒 II-DNA III Cosmid I II III II + III I + II + III 023 强化基因转录的元件是 【C】 密码子 复制子 启动子 内含子 外显子 024 启动子的特征之一是 【B】 GC 富积区 TATA Box 转录起始位点 长度平均 1 kb 含有某些稀有碱基 025 下列基因调控元件中属于反式调控元件的是 【A】 阻遏蛋白 启动子 操作子 终止子 增强子 026包涵体是一种 【E】 受体细胞中难溶于水的蛋白颗粒 大肠杆菌的亚细胞结构
12、 噬菌体或病毒 DNA 的体外包装颗粒 用于转化动物细胞的脂质体 外源基因表达产物的混合物 027 外源基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达的优点是 【】 I 融合基因能稳定扩增 II 融合蛋白能抗蛋白酶的降解 III 表达产物易于亲和层析分离 III I + II I + III II + III I + II + III 028 第二代基因工程是指 【C】 途径工程 代谢工程 蛋白质工程 RNA 基因工程 细胞器基因工程 029 基因工程菌中重组质粒的丢失机制是 【】 重组质粒渗透至细胞外 重组质粒被细胞内核酸酶降解 重组质粒在细胞分裂时不均匀分配 重组质粒杀死受体细胞 重组质粒刺激受体细
13、胞提高其通透性 030利用毛细管作用原理，将凝胶电泳分离后的DNA片段转移至硝酸纤维素膜上并根据核酸杂交原理进行分析的技术是【】 Western 印迹转移技术 Northern 印迹转移技术 基因的表现型分析法 Southern 印迹转移技术031在翻译过程中mRNA必需首先与核糖体相结合才能进行蛋白质合成。在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点，一个是起始密码AUG，另一个是【】 启动子 调节基因 SD序列 终止子二、填空题答案1、型限制性内切酶可特异性地识别 呈双重螺旋对称结构的特定双链DNA序列 并进行切割。如Bst B(TT CGAA）消化可产生 含5 CG 3的5磷酰基端黏
14、性末端 末端，Pst （CTGCA G）消化可产生5TGCA 3的3OH端黏性末端，而Sma（CCC GGG）消化产生 平 末端。2、识别顺序相同但切割位点不同者称 同位 酶，识别顺序与切割方式均相同者称 同裂 酶，来源与识别顺序均不同，但切割后形成的限制性片段有相同的粘性末端，称 同尾 酶。3、受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过，这种细胞称为 感受态细胞 。4、在翻译过程中，mRNA必需首先与核糖体相结合才能进行蛋白质合成。在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点，一个是 起始密码AUG ，另一
15、个是 SD序列 。5、在提取分离DNA的过程中，加入酚-氯仿、去垢剂或酶的目的是 使蛋白质变性或水解，除去蛋白质 ，使用金属离子螯合剂如EDTA等的原因 是细胞内有金属离子，如Mg2+，是酶活性的辅助因子，会使DNA被DNase分解，故除去使DNase活性的Mg2+以保护DNA不被变性或降解 。在小批量碱变性提取质粒过程中加入醇溶液的目的是 是DNA变性沉淀，并除去蛋白质、糖类等其他水溶性杂质，使之分离 ，加入Rnase的目的是 除去DNA沉淀中的RNA，是凝胶电泳检测时条带更明显 。6、PCR的全称是 聚合酶链式反应 ，它是一种在体外模拟DNA复制方式选择性地扩增DNA特殊区域的技术。它是在
16、四种 脱氧核苷三磷酸 存在下，以寡聚核苷酸为引物及 单链DNA 为模板，经DNA聚合酶催化合成DNA互补链的过程，其基本反应步骤为 高温变性 、 低温退火 和 适温延伸 ，并循环n次，达到扩增目的。7、采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子或其他生物样品有序地固化于支持物表面，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量的技术称为 生物芯片技术 ，根据固定的探针不同，可分为 基因芯片 、 蛋白芯片 、 细胞芯片 和组织芯片。该技术具有高通量、快速高效、高度灵敏等特点。8、根据Southern blot
17、的结果可以说明 被检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等 ，Northern blot 则用于 检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量 ，而Western blot的结果可以明 被检测基因在蛋白质水平上的表达状况 。9、基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系称为 表达系统 。10、用火药爆炸或者高压气体加速将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接送入完整的植物组织或者细胞中，这一方法称为 基因枪法 。基因工程课程习题 问答题1、 基因工程的操作过程的主要步骤包括哪些？切、接、转、增、筛（检）（1）切获得DNA片段，取得目的基因；载体的选择与制
18、备。方法：从生物基因组中分离得到基因组DNA 酶切产物 从总RNA中分离得到mRNA ，再逆转录得到cDNA 人工合成化学合成；PCR（聚合酶链式反应）（2） 接DNA片段和载体DNA在体外连接，形成重组子。（3） 转将重组的DNA引入宿主细胞方式：转化某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，而使其基因型和表型发生相应变化的现象；转染除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程；转导用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过程。还有显微注射等。（4）增培养已转化细胞，使目的基因在其中进行复制、扩增，并将其整合到受体细胞的基因组中。（5）筛、检重组子的筛选与鉴定。筛选
19、和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞。2、什么是限制性核酸内切酶？第二型限制酶有何特点？限制性核酸内切酶（限制酶，restriction endonuclease）是一类能够识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的核酸内切酶。第二型限制酶特点:2亚基，单辅因子;识别序列是由4、5、6或7个核苷酸组成的特定核苷酸序列，识别位点双重旋转对称结构，切割与识别位点相同或相近。分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，不需ATP。3、分析影响限制性内切酶酶切的因素有哪些？（1）温度：大部分限制性内切酶最适反应温度为37，少数酶高于或低于这个温度。（2）
20、时间：合适，大多为1 h，可过夜反应。（3）溶液体系：要求有稳定的pH环境。标准的缓冲溶液中含有氯化钙、氯化镁或氯化钾、Tris-HCl、-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清蛋白质（BSA）和Mg2+，具有一定的酸碱值即pH值。（4）盐离子浓度：不同的限制性内切酶对盐离子强度（Na+）有不同的要求，一般按离子强度不同分为低（0mmol/L）、中（50mmol/L）、高盐（100mmol/L）三类。Mg2+也是限制性内切酶酶切反应所需。（5）反应体积和甘油浓度：在进行酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%，若加酶体积太大，甘油浓度过高，则会影响酶切反应。（6）DNA的纯度和结构：D
21、NA样品中所含的蛋白质、有机溶剂及RNA等杂质均会影响酶切反应速度和酶切的完全度，酶切的底物一般是双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应。4、一个典型的原核表达质粒的主要元件有哪些？基因工程P53能在宿主细胞中自主复制的序列即复制子；控制转录的启动子如lac、trp等；选择标记的编码序列如各种抗生素抗性基因；多克隆位点（MCS）；转录调控序列，如一个合适的核糖体结合位点和起始密码子ATG等。5、以人工构建的pBR322质粒为例说明基因工程载体的特点。v 有多个限制性内切酶单一位点（EcoR，Hind等） v 四环素抗性基因Tetr和氨苄青霉素抗性基因Ampr ，且Tetr中有BamH I
22、（GGATCC）切点，Ampr中有Pst切点（CTGCAG）和Sal I切点（GTCGAC）。 可以通过Ampr Tets来筛选重组体。插入失活筛选原理。v 在细胞中是多拷贝的，是松弛型复制子。v 具有复制起始点（ori)。v 分子量较小，安全。6、小批量碱变性提取质粒DNA的原理与基本过程如何？碱变性法是常用的质粒抽提方法，其原理是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH
23、值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 小批量碱变性提取质粒DNA的基本过程为 （1）酶或机械法等方法破坏细胞，释放出胞内物质； （2）加碱使DNA与蛋白质变性，加中和液复性。因为质粒DNA分子量小易复性，从而使得其与基因组DNA分离； （3）在上清液中通过酚氯仿抽提、去垢剂或酶使剩余蛋白质变性或水解，除去蛋白质； （4）再加入醇溶液使质粒DNA变性沉淀而与其他水溶性物质分离； （5）将沉淀溶解于有RNase的TE溶液中，温育降解RNA后电泳
24、检测、-20 保存。7、什么是基因文库？基因组文库与cDNA文库制备方法有何区别？通过克隆技术将大分子DNA编码的全部或者绝大多数基因或基因组进行扩增后的DNA片段混合物，称为基因文库或DNA文库、克隆库。分为基因组文库和cDNA文库两种。基因组DNA文库的制备：从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法（超声波、搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切酶的不完全酶解）将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬菌体、粘粒或YAC载体）连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组
25、各DNA片段克隆的集合体，就是基因组文库。cDNA文库的制备：提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，许多细胞一起组成包含着某细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。8、PCR的定义、原理、方法？在生命科学领域有何具体用途？ 一种在体外模拟DNA复制方式选择性的扩增DNA特殊区域的技术，又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法。是在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物及单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成DNA互补
26、链的过程。原理与方法:1. 高温变性 双链DNA在高温下解链（变性）变成单链的过程;2. 低温退火 降温后变性的单链DNA可按照A=T, C三G 特异性配对的原则重新结合恢复双链结构; 同模板DNA特异性互补结合的引物的结合3. 适温延伸 DNA聚合酶的酶促作用, 即可沿引物DNA的5向3末端合成、延长与模板互补的核苷酸链;4.循环n次。用途： 1. 特异性扩增目的（模板）DNA。 2. 特异性检测目的RNA（如表达水平）（通过反转录酶反应） 3. 用于基因重组（扩增特定DNA片段） 4. 制备特异性探针 5. 用于DNA测序 6. 用于基因定位分析 7. 通过诱变寡核苷酸引物产生各种突变体
27、8. 用于分析基因组DNA的多态性(Random Amplified Poly-morphic DNA = RAPD) 9. 构建cDNA或基因组DNA文库 （从mRNA或基因组DNA中） 10.实时荧光定量PCR：DNA或RNA的绝对定量分析 9、琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么？琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。 DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。 DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。 具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分
28、离。 相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子泳动速度不一样。10、什么是原位杂交技术？其基本过程如何？根据核酸杂交原理，利用基因探针检出培养板上重组转化体菌落位置的技术。基本过程：（1）将硝酸纤维素滤膜铺放在生长着转化菌落的平板表面，使其中的质粒DNA转移到滤膜上。 （2）取出滤膜，作溶菌、碱变性（0.5mol/L NaOH）， 酸中和（Tris.Cl pH7.4）等处理后，转移到一张干的滤纸上，置于室温2030min，使滤膜干燥。将滤膜夹在两张干的滤纸之间，在真空烤箱中于80烘烤2h，固定DNA。 （3）带有DNA印迹的滤膜同32P标记的适当探针杂交、以检测带有重组质粒（含有被研究的DNA
29、插入片段）的阳性菌落。（4）将放射自显影的X光底片同保留下来的原菌落平板对照，从中挑出阳性菌落供作进一步的分析研究。11、什么是启动子?什么是SD序列？启动子(promoter，P)：是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列(40bp-60bp) 。富含A-T碱基对，具有保守序列：-10区（pribnow box）：TATAAT；-35区： 不同的启动子的效率不同，强启动子指导产生较多量的mRNA，弱启动子指导下转录合成的mRNA很少。启动子的强度主要决定于启动子的结构。原核生物RNA聚合酶不能识别真核细胞启动子，因此真核基因在原核生物表达时，应将真核基因置于原核生物强启动
30、子下，以实现高效转录。 在原核生物中，mRNA起始密码子AUG上游3-11bp处一段能与16SrRNA3端序列互补的富含嘌呤的碱基序列称为SD序列(SD sequence）。mRNA分子上有两个核糖体结合位点，一个是起始密码AUG，另一个是起始密码AUG上游处的一段的序列后者称为SD序列。 12、什么是操纵子？请用简图表示操纵子的基本结构并以乳糖操纵子负调控系统（阻遏蛋白调控作用）为例说明其功能。 操纵子是原核生物转录单位。操纵子组成为结构基因连同其上游的调控序列(启动子 promotor P、操纵基因operator O、其他调节序列)共同构成一个操纵子。无诱导物（乳糖）时，阻遏物基因I产生
31、的阻遏蛋白与操纵基因结合，位点关闭， RNA多聚酶通不过，转录不进行，基因关闭；有诱导物（乳糖）时，诱导物与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白失活，从o点脱离，o位点打开，RNA多聚酶通过，Z、Y、A转录。即基因表达。13、为什么用原核表达系统表达真核生物的蛋白质时，克隆的真核基因不能来自基因组文库？真核基因应如何获得？ 对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。因为原核细胞不具有mRNA转录后加工系统，不能进行剪接、去除内含子等操作，所以 用原核表达系统表达真
32、核生物的蛋白质时，克隆的真核基因不能来自基因组文库，应从cDNA文库中获得，或者通过提取mRNA后RT-PCR方法获得。 14、如何提高真核基因在原核宿主中的表达效率？（1）选择合适载体，提高翻译水平 n 强启动子提高转录水平n 核糖体结合位点（ATG-SD）距离合适 在基因重组过程中应将结构基因接于SD序列之后以便为mRNA提供核糖体结合位点，提高真核基因表达效率。n 避免产物降解 ：分泌/融合表达；（融合蛋白表达后再去除原核肽段）（2）选择合适宿主(如 Lac 启动子LacI菌；PL/PRCI857溶源菌)（3）调节宿主细胞代谢 为保持宿主正常生长速度及重组转化体稳定性，维持产物的高效表达
33、，必需采用适当方法，调节细胞代谢。目前，调节细胞代谢方法很多。如营养物浓度控制、产物诱导表达、载体诱导复制及促进产物分泌等。15、什么是基因诊断？基因诊断中常用的方法有哪些？试简述其中一种方法的原理。基因诊断是指用分子生物学的技术对引起疾病的原因遗传基因、致病微生物和寄生虫,以及某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞遗传基因的检测和分析。基因诊断中常用的方法有核酸分子杂交、PCR、DNA芯片技术、限制酶酶谱分析和DNA序列测定等。 核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。它的基本原理是：互补的核酸单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA
34、和RNA之间进行。因此，当用一段已知基因的核酸序列作探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。16、名词解释：基因探针 基因芯片 蛋白质工程基因探针（probe）：就是一段与目的基因DNA互补的带有能检测标记物的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。基因芯片(gene chip)：又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定于支持物上，样品DNA/ RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后
35、按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。 蛋白质工程：是指在蛋白质空间结构和结构与功能研究的基础上,借助计算机等辅助设计来确定某一蛋白质分子的改造方案。然后通过基因改造和基因工程技术获得新的蛋白质分子。17、简述包含体形成的原因和包含体蛋白复性的主要步骤。重组蛋白在细菌中表达时，尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，会在细胞内与细菌杂蛋白、核酸等成分聚集成没有生物活性的直径0.1-0.3m的固体颗粒，这种不溶性聚合体即包含体（inclusion body）。生成包含体的原因可能有是蛋白质
36、合成速度太快，多肽链相互缠绕，影响了多肽链的正确折叠，导致疏水基团外露等。 （包含体的形成有利于防止蛋白酶对表达蛋白的降解，并且非常有利于分离表达产物。但包含体形成后，表达蛋白不具有生物活性，因此必须溶解包含体并对表达蛋白进行复性。）包含体复性即从伸展态中间体后期中间体天然态的过程，操作步骤一般为用超声波、匀浆等使菌体破碎后，离心得到包含体加入强蛋白质变性剂如6 8molL盐酸胍或910molL尿素溶解包含体用透析、稀释和超滤复性法等等方法使之正确折叠。18、列表比较大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞表达系统的优缺点。以下为某同学作业答案，供参考表达系统优点缺点大肠杆菌表达系统（1）对大肠
37、杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻了解；（2）是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；（3）许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；（4）大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。（1）缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA,不宜表达真核基因组DNA；（2）缺乏翻译后加工机制，许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；（3）表达的蛋白质常形成不溶性包含体，需作复性处理；（4）难于表达大量可溶性蛋白。酵母表达系统（1）基因背景了解清楚，上游
38、操作简单，生长迅速，非常适于大规模发酵。（2）具有一定的加工及修饰能力：如二硫键的正确形成，前体蛋白的水解加工。表达产物与天然蛋白相同或类似。（3）可将异源蛋白基因与N-末端前导肽等信号肽融合，指导新生肽的分泌，在分泌中可对表达的蛋白进行糖基化修饰，但其修饰糖链与高等真核细胞并不相同。（4）可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题。 （1）产糖量过多因而损坏蛋白质的生物活性、安全性等；（2）糖基化修饰与高等真核细胞并不相同。 昆虫细胞表达系统（1）表达效率高。重组蛋白的表达水平最高可达到细胞总蛋白的50。（2）属于真核表达系统。有糖基化作用、脂肪酸酰基化作用、氨基末端乙酰化
39、作用以及磷酸化，有利于表达产物形成天然的高级结构，保持原有的生物活性与功能。（3）杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖。（4）杆状病毒属于昆虫病毒。具有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性。病毒重组因失去多角体保护，在自然界的生存能力很弱，因此比较安全。（5）应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因可表达毒性蛋白。（6）杆状病毒表达载体通用性广。可表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因。（7）重组杆状病毒除在体外昆虫培养细胞表达外源基因外，还能感染昆虫活体，在体内高效表达外源蛋白。（1）宿主细胞生长慢、 培养基昂贵、 含有免疫宿
40、主蛋白、 杆状病毒感染会导致宿主死亡、因此每一轮蛋白合成均需重新感染。（2）昆虫细胞内的糖基化方式与脊椎动物细胞内的糖基化方式有一定的差异，其糖蛋白的糖链结构多为简单的不分支结构。 哺乳动物细胞表达系统 （1）产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最精确。（2）一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。该表达系统的表达水平较低、培养基昂贵、生长缓慢、含有过敏物质等缺点在实际应用过程中较难避免。19、利用基因工程菌生产有哪些特点？有什么优势？常用的宿主菌有哪些？基因工程菌带有外源基因，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为
41、了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。利用基因工程菌生产的优势主要体现在目的产物产量高，表达调控性好，可根据目的产物特点构建各种表达系统，等等。常用宿主菌有大肠杆菌（如BL21(DE3)plysS菌株）、酵母菌（如Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae等）、枯草芽孢杆菌等。20、在基因工程菌培养过程中为什么质粒会丢失？（1）分离的不稳定性：细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNA拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体。即在细胞分裂过程中
42、发生的质粒不平均的分配，导致质粒丢失，亦叫做质粒分离的不稳定性。 （2）培养体系中因为各种原因使选择压力消失，无质粒载体细胞速度快，而含有质粒载体的寄主细胞重了代谢的负荷，降低了生长的速度，最终体系中前者占多数。（3）DNA重组等其他原因。21、基因工程菌高表达的障碍是什么？（1）外源基因的不稳定，造成表达的下降。如受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解等原因。（2）高生长速率与高表达之间的矛盾。外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢。（3）乙酸的产生。菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸，严重影响产物表达。（4）蛋白的降解。
43、小分子蛋白在大肠杆菌中表达后不稳定，容易被细胞内蛋白酶降解失活，可采用融合表达方式加以解决。22、与大肠杆菌相比酵母作为宿主菌有什么优点？酵母菌是单细胞低等真核生物，易于培养、繁殖快、便于基因工程操作。与大肠杆菌相比其优点为：（1）具有真核生物的蛋白质翻译后加工的基本功能，如二硫键的正确形成，前体蛋白的水解加工、糖链加工；具有适合于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和系统，表达产物与天然蛋白相同或类似。（2）可将异源蛋白基因与N-末端前导肽等信号肽融合，指导新生肽的分泌，分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化。（3）可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题。基因工程实验作业题
44、如果电泳结束后紫外灯下看不到条带，请分析可能的原因。（1）DNA降解（避免核酸酶污染） （2）上样量不够（3）光源不合适（254nm 透射）（4）SYBR GREEN I等染料量过少或漏加（5）胶浓度不合适（根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5左右。 ）（6）核酸提取、PCR反应失误等等上样缓冲液的作用 ？（1）螯合Mg 2，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/l的EDTA。 （2）增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。（在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和拖尾现象）。 （3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，其率约与300bp的线状双链DNA相同。 请分析PCR出现假阴
