富硒金针菇菌株的选育.doc

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1、富硒金针菇菌株的选育毕业论文毕业论文富硒金针菇菌种的选育摘 要目的：食用菌以其独特的营养价值、药理作用和简易高效的生产工艺等优势备受青睐。金针菇（Flammnlina velutipes）作为食用菌中的一朵奇葩，更有美味可口、营养丰富、抗癌治溃疡等作用。目前对金针菇的营养成分报道较多，本文对金针菇菌丝体及其紫外诱变体的最佳富硒能力的培养基硒含量、菌丝生长特性、平板富硒培养与液体富硒培养、菌丝体硒含量等做了探讨。方法：本实验配置马铃薯综合培养基、紫外菌丝体诱变、富硒CM培养基培养金针菇201和白色金针菇；针对固体平板培养，采用十字交叉法测量菌落半径，使用乳酸石炭酸棉蓝染色液将菌丝染色，测其菌丝直

2、径；针对液体发酵，使用游标卡尺测量菌丝球直径，收集菌丝球于称量瓶，在电热恒温干燥箱中烘干至恒重，用电子分析天平称其干重；使用紫外分光光度法测定菌丝含硒量；对实验数据的处理采用EXCEL制图、SPSS统计分析处理。结果：白色金针菇、金针菇201及其诱变菌种均能在含硒量为2035g/L的培养基上生长速度达到最快，富硒能力最强的状态。结论：相对于固体平板培养，液体发酵培养菌丝体的生长速度及富硒能力达到新的高度。关键词：金针菇；硒；紫外诱变；固化富硒培养；液体摇床培养The Breeding of Selenium-accumulating Strain of Flammulina velutipes

3、sAbstractSubject: Edible fungi is extremely popular for its unique nutritional value, high-efficiency production process, and pharmacological effects. Flammulina velutipes, as a delicious and eutrophy fungi, also have the curative effect to anti-cancer and ulcers. At present, the nutrition constitue

4、nt of Flammnlina velutipes is reported mostly, this research is about to discover the fittest one for mycelium of Flammulina velutipes and its UV-irradiation in selenium-accumulating media content, growth characteristics, differences between flat cultivation and cultivation of liquid selenium of sel

5、enium- accumulating mycelia, and selenium content of mycelium. Methods: This research configure potato integrated medium, ultraviolet radiation mutagenesis on mycelium, and Se- accumulating CM medium for training Flammnlina velutipes 201 and white Flammnlina velutipes. In the plate culture, I measur

6、e colony radius by cross cross method, lactic acid carbolic acid cotton blue dyeing liquid will be used in mycelium dyeing, measuring its mycelium diameter. In the liquid fermentation, calculate mycelium ball diameter by Vernier caliper. Mycelium ball in the bottle, drying to constant heavy in the e

7、lectric thermostat dry box, calculate its dry heavy with Precision electronic balance. Using ultraviolet Spectrophotometric method determinates of selenium content of mycelium. The excel mapping and SPSS statistical analysis will be used in the processing of experimental data. Results: When selenium

8、 concentration of culture is 2035 g/l, the fastest growth rate and selenium status of the most powerful of Flammnlina velutipes 201 and white Flammnlina velutipes and mutation strain will be achieved in the culture. Conclusions: Comparing with the plate culture, mycelium growth rate and capacity of

9、Se-accumulating reaches new standard in the liquid fermentation.Key words: Flammnlina velutipes；Selenium；ultraviolet radiation mutagenesis；Se- accumulating plate culture；Se- accumulating Liquid training目 录1 引言11.1 金针菇的特性11.2 硒的生理生化功能11.3 人体所适宜的膳食硒浓度12 材料和方法22.1 材料22.1.1 菌种22.1.2 药品22.1.3 培养基32.1.4仪器

10、及设备32.1.5耗材32.2 方法32.2.1 一级菌种培养基的配置方法32.2.2 菌丝体转管52.2.3 紫外诱变52.2.4 菌丝体的活化与复壮62.2.5菌种保藏62.2.6固化富硒培养62.2.7液体富硒培养72.2.8固化金针菇菌丝的形态学检测72.2.9液体培养金针菇菌丝球的形态学检测82.2.11 标准曲线的制作93 结果与分析（讨论）103.1 紫外诱变对金针菇形态学特征的影响103.2 金针菇在液体富硒培养中的特性103.2.1金针菇在液体富硒培养基中的生长特性113.2.2 金针菇在液体富硒培养基中的富硒特性133.3 对白色金针菇和金针菇201及其诱变菌种的相关参数的

11、统计分析293.3.1 紫外诱变对白色金针菇和金针菇201的生长速率以及富硒能力的影响293.3.2 白色金针菇和金针菇201的生长速率以及富硒能力的独立样本t检验303.3.3 固体、液体培养对金针菇生长速率和富硒能力的独立样本t检验304 结论与展望314.1 结论314.2 展望31参考文献32附录33培养基配置的原则33pH值标准溶液配置说明33高压蒸汽灭菌的方法步骤34一级菌种转管的注意事项34致谢35III富硒金针菇菌种的选育1 引言1.1 金针菇的特性金针菇含有丰富的营养，美味可口，对儿童的健康成长和智力发育有益。18种氨基酸，其含量高于一般菇类,又称“增智菇”。金针菇体内的“冬

12、菇素”和多糖体朴菇素，是非常有效的抗癌活性物质，预防高血压降低胆固醇，治疗消化道炎、肝炎等疾病1。1.2 硒的生理生化功能硒是人体必须的微量元素之一，能够提高免疫力、抗氧化、提高基础代谢等作用，在人体中扮演着非常重要的角色。硒的缺乏将容易导致大骨节病和克山病的产生2，以及与免疫功能的丧失、癌症的发生有着较大的关系3，以及是体内红细胞谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成部分4。硒浓度过高，也会对人体产生毒性5。硒也能够减弱微量元素毒性6。1.3 人体所适宜的膳食硒浓度硒元素是人体内不可缺少的必需元素，硒缺乏克山病、大骨节病。它在人体内扮演这重要的角色。但是摄入过多，对人体有害。因此补硒是有一定的标准。无

13、机硒在金针菇体内高效的转化为有机硒，成为硒蛋白、硒多糖等7。不同的硒浓度，其产生的生物学效应是不同的。1.3.1 补硒标准有关硒的摄入量的研究，WHO等三个国际组织已经给出标准：以预防克山病等疾病发生为界限的最低需要量17g/d，以GPx达到饱和为正常生理功能指标的生理需要量40g/d，膳食硒供给量50250g/d，膳食硒最高安全摄入量400g/d，以指甲变形的界限中毒剂量的800g/d8。1.3.2 富硒食品的开发仅仅依靠膳食中低水平硒的摄入，这会对人体健康产生潜在的威胁。因此，研发富硒食品具有非常重要的意义。目前国内外的富硒食品的开发主要有以下几个途径。富硒地区土壤中富含硒的特点生产富硒食

14、品；植物转化提高产品中的含硒量；通过动物富集获得富硒产品；利用微生物转化法生产富硒产品9。2 材料和方法2.1 材料2.1.1 菌种田野金针菇201，由合肥市田野菌业有限公司提供；诱变菌种201.5和201.10，系由菌种田野金针菇201（合肥市田野菌业有限公司提供）分别经5min和10min紫外诱变、筛选获得，未经诱变的田野金针菇201记为201.0；野树林白色金针菇，由芜湖野树林生物科技有限公司提供；诱变菌种白.5和白.10，系由菌种野树林白色金针菇（芜湖野树林生物科技有限公司）分别经5min和10min紫外诱变、筛选获得，未经诱变的野树林白色金针菇记为白.0。2.1.2 药品 灭菌用试剂

15、乙醇：75%乙醇主要用于接种操作时的工作台面、接种工具、菌种容器表面和操作员手的消毒。 培养基用试剂马铃薯、葡萄糖、KHPO、硫酸镁、琼脂、维生素B、水、KHPO、蛋白胨硒储备液（配合固化CM培养基和液体CM培养基，制备不同硒浓度富硒培养基）使用分析天平称取亚硒酸钠0.219g，溶解于蒸馏水中，定容至100ml，此溶液含硒1g/L；稀释至含硒1g/ml，获得硒储备液。 染色剂（用于菌丝体的镜检）乳酸石炭酸棉兰染色液 硒标准液（用于硒标准曲线的制作）使用分析天平称取亚硒酸钠0.219g溶解于蒸馏水中，定容至100ml；摇匀后取3.0ml，加蒸馏水定容至100ml，制得硒标准液，含硒30g/ml。

16、 硒含量测定试剂硫酸高氯酸消解液：3V浓硫酸与4V高氯酸的混合液；钼酸钠溶液：于少量蒸馏水中溶解10g钼酸钠，加蒸馏水定容至150ml；40%盐酸羟胺溶液:称取40g盐酸羟胺溶于蒸馏水中，定容至100ml；0.2mol/LEDTA：称37gEDTA二钠盐，加蒸馏水搅拌溶解，稀释至500ml；1:1（V/V）磷酸溶液：取50ml磷酸，加50ml蒸馏水；0.2%邻苯二胺溶液（现配现用）：取0.2g邻苯二胺，溶解于少量蒸馏水，并定容至100ml。甲苯。（以上试剂均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司）2.1.3 培养基马铃薯综合培养基（菌丝活化和菌种保持用）马铃薯：200g；葡萄糖：20g；K

17、HPO: 3g；硫酸镁：1.5g；琼脂：120g；维生素B1：10mg；水：1000ml。固化CM培养基（配合各个硒浓度梯度，进行固体平板菌丝富硒培养）蛋白胨：2g；葡萄糖：20g；KHPO: 0.46g；硫酸镁：0.5g；KHPO: 1g；琼脂：18g；水：1000ml液体CM培养基（配合各个硒浓度梯度，进行液体摇床菌丝球富硒培养）蛋白胨：2g；葡萄糖：20g；KHPO: 0.46g；硫酸镁：0.5g；KHPO: 1g；水：1000mL（以上试剂均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司）2.1.4仪器及设备显微镜 CX21FS1 南京江南永新光学有限公司电子天平 YP2002 上海越平科

18、学仪器有限公司美菱冰箱 BCD-221CHC 合肥美菱股份有限公司电热恒温水浴锅 DK-S24 上海精宏实验设备有限公司电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9246A 上海精宏实验设备有限公司电热恒温干燥箱 DHG-9147A 上海精宏实验设备有限公司游标卡尺 GB/T1214.2-1996 上海量具刃具厂电热恒温培养箱 DNP-9272 上海精宏实验设备有限公司数字式pH计 pHS-25 上海理达仪器厂立式压力蒸汽灭菌器 LDZX-50KBS 上海申安医疗器械厂全温培养摇床 QYC-200 上海新苗医疗器械制造有限公司电子分析天平 BN 0313 上海民桥精密科学仪器有限公司紫外可见分光光度计 UV

19、-1100 上海美谱达仪器有限公司2.1.5耗材镜台测微尺、石英比色皿、玻璃比色皿、双层铁皮电炉2.2 方法2.2.1 一级菌种培养基的配置方法 材料准备10 马铃薯、葡萄糖、KHPO、硫酸镁、琼脂条、维生素B1、水、1%盐酸、75%乙醇、1%氢氧化钠溶液。 仪器准备 电子秤、电炉、搪瓷缸、脱脂棉、称量纸、玻璃棒、石棉网、烧杯、大试管、pH计、漏斗、铁架台、乳胶管、小木条、锥形瓶、橡胶塞、棉线、纱布。 热浸提 选取新鲜、洁净、没有发芽、变青的马铃薯200g，洗净、去皮、挖眼，切成1cm的小块。将切好的马铃薯小块放入1000ml水中，电炉加热煮沸后用文火保持30min，此间应注意用玻璃棒搅拌，防

20、止溶液上层漫出。煮至搅拌基本没有阻力即可。 过滤 煮好后，用4层纱布过滤取马铃薯汁液。并加水至1000ml。 琼脂融化 称取琼脂20g，洗净剪碎，加入马铃薯煮出液中，用文火加热，边煮边搅拌，直至全部琼脂融化，再用4层纱布过滤取滤液。 定容 准确称取10mg维生素B1、20g葡萄糖、3g KHPO、1.5g硫酸镁，逐一加入液体中，并用热水补足至1000ml。 调节pH 加水定容后，用pH计测定培养基中的pH，使用盐酸或者氢氧化钠溶液将酸碱度调至6.26.8。pH计的pH值校准与使用参见附录。 分装试管 先在玻璃漏斗嘴上套一段乳胶管，卡上止流夹，将培养基倒入漏斗中。左手握住大试管，让乳胶管伸入大试

21、管中部，右手拇指和食指按下止流夹，逐一注入培养基，装入量以试管容积的为宜。分装时不要让培养基沾在大试管口上，若以沾上，要用干净纱布擦干净。剩余的综合马铃薯培养基倒入锥形瓶。 塞棉塞 两层纱布将脱脂棉包裹起来，棉线将其系紧。塞进试管。 灭菌 将试管捆成束，并用牛皮纸将试管口、棉塞部分扎好，装进灭菌锅内进行灭菌。对于锥形瓶，直接将橡胶塞塞上，包上牛皮纸。灭菌的方法步骤见附录。 超净工作台的灭菌 在超净工作台下放一根长50cm的小木条，厚度为1cm左右。使用75%乙醇将超净台的工作台面和小木条消毒。开启紫外灯，30min后关闭。 斜面摆放 一般试管斜面培养基灭菌后需要在室内取出摆成斜面，这有两个缺点

22、：一是摆放斜面时没有足够的热量将棉塞中的水分烘干，从而易沾上杂菌；二是培养基从灭菌锅内取出后，高温水蒸汽在培养基凝固过程中遇外界低温形成冷凝水。二者均不宜金针菇的生长。缓慢降温可以避免湿棉塞和冷凝水的出现。在高温季节，培养基灭菌后，待锅内温度降至50时，取出大试管，将大试管头部枕在小木条上，使管内培养基自然倾斜，斜面长度为试管长度的，覆盖保温物让其自然缓慢冷却，凝固后即成斜面培养基。 斜面无菌检验 将灭菌后的斜面放置28恒温箱内培养3d，剔除被污染的斜面。2.2.2 菌丝体转管 材料准备 接种钩、棉球、镊子、75%酒精棉球、75%酒精、金针菇母种培养基、酒精灯 超净工作台的灭菌 在接种前，取7

23、5%酒精棉球蘸上75%酒精将超净工作台表面消毒，将待接种的斜面培养基放入超净台内，并开启紫外线灯灭菌30min。 取75%酒精棉球蘸上75%酒精擦拭双手、超净台的工作台面、接种工具、金针菇母种试管的表面。 菌丝体的转管 点燃酒精灯开始接种操作。接种操作需靠近火焰，但注意不要灼伤菌种。将所要母种和斜面培养基用大拇指和其他四指并排握住，斜面向上，并使试管位于水平位置。右手轻轻松动棉塞，以利于接种时能较容易的拔出。右手拿接种钩，在装有酒精的瓶子中蘸一下，然后在火焰上烧红，进行灼烧灭菌。用右手小指和无名指拔掉棉塞。在火焰上灼烧试管口，灼烧时应转动试管，将其沾上的少量杂均烧死。将灼烧过的接种钩伸入母种试

24、管内，放在试管内壁停留片刻使之冷却以免烫伤菌种。在菌丝浓密处，取出1.0cm大小的菌种块，迅速抽出，不要碰到管壁。迅速通过酒精灯火焰无菌区，把菌种块送入斜面培养基的中央。灼烧试管口，并将棉塞在火焰上迅速过一下，塞上。将接种钩在火焰上灼烧至红，放回超净台。将接好的试管贴上标签，注明菌种名称和接种时间，放在25培养9d长满斜面。2.2.3 紫外诱变 材料准备 报纸、棉球、75%酒精、75%酒精棉球 仪器准备 培养皿、酒精灯、电热恒温鼓风干燥箱、电炉 培养皿干热灭菌 取培养皿12套，洗净后晾干。取6套培养皿，使用报纸包扎起来。另外6套的处理方法与此相同。将上述12套培养皿放入电热恒温鼓风干燥箱灭菌，

25、将其温度设置为130，时间设置为4h。 超净台的灭菌 取75%酒精棉球蘸上75%酒精将超净工作台表面消毒，并开启紫外线灯灭菌30min。 融化培养基 将装满水的锅放置电炉上，插上电源，加热。内部装有综合马铃薯培养基的锥形瓶放置在锅内，水浴加热。培养基完全融化后取出，放置在超净台上。 倒平板 取酒精棉球，蘸上酒精后，擦拭锥形瓶表面。趁热倒平板，培养皿的握法如下：将已灭菌的培养皿放置在超净台上。点燃酒精灯。右手小拇指和无名指拖住培养皿的底部，大拇指和中指卡在培养皿的侧面，食指扣在培养皿的上部。在酒精灯火焰的无菌区，将锥形瓶中的培养基倒在培养皿中，厚度以培养基能覆盖培养皿底部即可。 平板无菌检验 将

26、平板放置28恒温箱内培养3d，剔除被污染的平板。 超净台的灭菌 接种 点燃酒精灯，将复壮后的白色金针菇和金针菇201，使用接种钩，在菌丝浓白粗壮处取出0.5cm大小的菌种块。在火焰无菌区，左手拿培养皿，将菌种块转接至平板上。 菌丝体紫外诱变 将超净台面清理干净，使用酒精棉球蘸上酒精，擦拭超净台面。揭开培养皿的盖子，开启紫外灯，直接照射菌种块上的菌丝体，进行紫外诱变，一批照射5min，一批照射10min。 恒温箱培养 紫外诱变后，将平板放置电热恒温培养箱中培养9d。2.2.4 菌丝体的活化与复壮 将2.3.2中获得的金针菇201和白色金针菇菌丝体，继续转管2次，每次培养9d。 将2.3.3中获得

27、的诱变体201.5、201.10、白.5、白.10转管2次，每次培养9d，使其活化。 每次转管都应在菌丝浓白粗壮处挑取菌种块。2.2.5菌种保藏菌种保藏的目的就是使菌种在较长期的保藏之后，不被杂菌污染，仍能保持原有的生活力和生产性能，其形态特征、理化特性和遗传性状不会发生改变。稳定的保藏保证了优良菌株的高产优质，也可以作为分离菌株的对照和验证研究结果。菌种保藏的原理就是通过降低营养、缺氧、干燥、低温等手段，降低菌株的新陈代谢，使菌种暂时处于休眠状态，抑制菌丝的生长和繁殖，从而降低其变异率。菌种保藏的方法有多种，斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、半固体穿刺保藏法、沙土管保藏法、加入保护剂冻存保藏法

28、、冷冻真空干燥保藏法等11。我们采用斜面低温保藏法，具体方法是将金针菇菌种接种于马铃薯综合培养基中，25条件下培养。培养过程中要勤检查,当菌丝体长满斜面，及时挑选无污染、菌丝浓白粗壮的固化菌种,放在4冰箱中保藏,每隔3个月时间移植转管一次。保藏时棉塞部分需用灭过菌的牛皮纸包扎棉塞,以防培养基干燥，也可降低污染的机会。2.2.6固化富硒培养本次实验，我将培养基富硒浓度梯度设置为0、5、10、15、20、25、30、35、40(g/L)12。 配置固化CM培养基 取9个锥形瓶编号。向9个锥形瓶中各加入硒储备液0、1、2、3、4、5、6、7、8mL。配置固化CM培养基，分装至锥形瓶中，200mL/个

29、，摇匀，获得各个硒浓度梯度的固化富硒CM培养基母液。 灭菌 锥形瓶用8层纱布、牛皮纸包扎后，放入灭菌锅中灭菌。温度设置为115，时间为30min。打开超净台上的紫外灯，灭菌30min。 倒平板 在超净台灭菌后，取已灭菌的培养皿54套。取出锥形瓶，将200mL富硒CM培养基母液分装至6套培养皿。将培养皿贴上标签。白.5.0中的“0”代表培养基含硒量为“0”，其他以此类推。 平板无菌检验 将已灭菌的斜面置于25恒温箱内培养3d，只有培养基表面及基质内无任何杂菌菌落出现，说明已达到灭菌目的，才可使用。 接种 将金针菇母种接种至富硒培养基，其中母种设置为田野金针菇201、野树林白色金针菇，诱变梯度设置

30、为5、10min，硒浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40（g/L）。设置一不接种的、不含硒的空白对照。 富硒培养 将平板置于电热恒温培养箱25，培养9d。2.2.7液体富硒培养我们将培养基富硒浓度梯度设置为0、5、10、15、20、25、30、40（g/L）。 配置液体富硒CM培养基 取8个锥形瓶编号。向8个大烧杯中各加入硒储备液0、3、6、9、12、15、18、24mL。配置液体CM培养基，向各个烧杯中加入液体CM培养基600mL，摇匀，获得各个硒浓度梯度的液体富硒CM培养基母液。 分装 取干净的锥形瓶48套。将每个600mL富硒CM培养基母液分装至6个锥形瓶中，贴上标

31、签。 pH测定 使用数字式pH计测定锥形瓶中的pH，pH自然即可。 培养基、超净台的灭菌 液体富硒培养基的无菌检验 与斜面无菌检验方法一致，在25恒温箱内培养3d后，只有当发酵液依然保持原来的清澈程度，才可使用。 接种 将金针菇母种接种至富硒培养基，其中母种设置为田野金针菇201、野树林白色金针菇，诱变梯度设置为5、10min，硒浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40（g/L）。设置一不接种的、不含硒的空白对照。 富硒培养 将平板置于全温培养摇床，温度设置为25，250r/min，培养9d。2.2.8固化金针菇菌丝的形态学检测 测定菌丝粗细、疏密程度、色泽。 测定菌落半径

32、利用十字交叉法，用游标卡尺测定菌落生长直径。计算菌丝平均生长速率。 测定菌丝直径13 使用镜台测微尺将显微镜的目镜测微尺校准。在载玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用镊子取出菌丝，放置在染色液中，使用40倍目镜测定其直径。 测干重 使用镊子尽量将培养基上的菌丝挑取出来，并且不可沾上培养基。收集菌丝体于称量瓶，在电热恒温干燥箱（温度设置为60）中烘干至恒重，用电子分析天平称其干重。2.2.9液体培养金针菇菌丝球的形态学检测 观察菌丝球的色、香、味、测定菌液pH、测菌丝球数目14。 测菌丝球直径 将液体富硒培养所获得的金针菇菌丝球及其培养基，倒入培养皿中。在大大小小的菌丝球中，选择其中较大的3个和

33、较小的3个，使用游标卡尺测定这6个菌丝球的直径，从而得出该培养基菌丝球的直径范围。 测干重 使用2层纱布过滤液体富硒培养基中的菌丝球，置于培养皿，加入蒸馏水充分洗涤，过滤。如此反复5次。收集菌丝球于称量瓶，在电热恒温干燥箱（温度设置为60）中烘干至恒重，用电子分析天平称其干重。 计算菌丝体生物量 菌丝体生物量是菌丝体干重（g）与液体培养基体积（mL）的比值15。2.2.10紫外分光光度法测定金针菇菌丝体中的含硒量在参考文献地基础上16，我们做了改进：1、明确了硫酸高氯酸消化时间和水浴锅加热反应时间，2、我们通过在通风处操作以及将锥形瓶盖上塞子，防止具有刺激性气味的白雾进入空气，危害身体健康，3

34、、将其中激烈反应这一并不明显的特征表现删除，4、将冒白烟这一特征改成冒白雾，其出现的时间我们按照实验事实做了更正，5、使用100水浴锅代替电沙浴达到节能效果，6、菌丝体与子实体不同，我们根据实验，将文献中加分析纯NaOH9.5g改为10.5g，7、明确提醒出可能会出现问题的地方，防止操作不慎产生恶果，8、提醒使用塑料瓶盛装浓NaOH溶液，9、硫酸高氯酸消解液配置好后应避光保存，10、因EDTA溶解度较低，实验中使用EDTA二钠盐代替EDTA。 消化 使用电子分析天平称取金针菇菌丝粉末0.0300g（平板获得的菌丝体取0.0100g），置于250mL锥形瓶中，使用移液管加入硫酸高氯酸消解液12m

35、l，塞上橡胶塞。在室温下放置24h，瓶中菌丝粉末被消化成糊状。 提硒 打开水浴锅，温度设定为100。在通风处，向锥形瓶中加入钼酸钠溶液3ml，可看到冒出白雾，钼酸钠加入完毕后迅速将塞子塞上，防止白雾扩散至空气中。轻轻地水平地摇匀1min，以防粉末颗粒粘到了锥形瓶的侧壁，导致消化不完全。然后将其放置在水浴锅中加热，瓶中产生大量翻滚的白雾。加热1h后，即溶液由糊状变成淡黄色时，取出锥形瓶置于台面上冷却。向溶液中加入蒸馏水35mL。在通风处，加入分析纯NaOH10.5g，此NaOH固体应少量多次加入，每次加入后摇匀，使其完全溶解，防止溶液爆沸。反应放热并有刺激性气体使用8mol/LNaOH溶液和pH

36、计调混合溶液pH为中性。依次加入40%盐酸羟胺溶液2mL、0.2mol/LEDTA溶液1mL、1:1(V/V)磷酸溶液2mL,加塞摇匀1min。 萃取 向溶液加入0.2%邻苯二胺溶液2mL,摇匀后静置2h。开启紫外分光光度计预热，设置波长为335nm。将锥形瓶移至紫外分光光度计旁的通风处,使用移液管加入甲苯10mL,振荡1min,将混合液倒入大试管（70mL）中,将大试管放入试管架上，静置10min。 测定 取上层甲苯于石英比色皿中，测吸收值。2.2.11 标准曲线的制作分别取硒标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，于250 mL锥形瓶中，相当于分别含硒0，6，12，18，24

37、，30g/mL，经过消化、提硒、萃取、测定步骤后，获得其在335nm处的吸收值。以硒含量为横坐标，吸收值为纵坐标绘图。以吸收值A对硒含量回归，获得回归方程。3 结果与分析（讨论）3.1 紫外诱变对金针菇形态学特征的影响紫外诱变实验中，选择金针菇201和白色金针菇两个菌种。我设置了0、5、10min中的时间梯度，随后在平板中培养，发现紫外诱变时间越长，菌丝体的生长速率明显下降，并且菌丝越显得瘦弱。3.2 金针菇在液体富硒培养中的特性针对菌丝培养后硒含量的测定，我使用石英比色皿和玻璃比色皿制作了两个标准曲线，数据表格及曲线图见表12和图12。实验中，针对金针菇201、白色金针菇及其紫外诱变菌种进行

38、了条件优化的液体富硒培养，使金针菇菌丝体在液体培养基中能够充分的接触到培养基。在液体富硒培养中，可以得出金针菇菌丝体各个菌株的不同特性。观察发酵液的浊度，菌丝球的色、香、味及其形状，测定菌液pH和菌丝球直径，测菌丝球数目及其干重，记录各个菌种各个梯度菌丝球干燥所需的时间。通过对上述菌株的生长状况进行了详细的记录与观察，得到不同富硒浓度对金针菇菌丝体的影响的结论。实验中的结果分别在下列的表格和数据图形中一一列出。其次，利用紫外分光光度法测定白色金针菇、金针菇201及其诱变菌株的单位质量下的含硒量。记录下生物量干重、吸光值，计算出菌丝体含硒量、含硒量提高倍数和回收率。回收率的计算公式如下：硒回收率

39、 =通过所得数据，比较菌丝体干重、菌丝体含硒量与硒浓度梯度的关系，获得回收率。表1：测定硒的标准曲线Table 1.Determination of selenium standard curve硒含量(g)0612182430吸收值00.1810.3700.5210.6270.788注：此次使用玻璃比色皿测定，每组设置3个重复，取平均值，获得标准曲线。y = 0.0259x + 0.0267R2 = 0.992300.10.20.30.40.50.60.70.80.905101520253035硒含量(g)吸收值图1：测定硒的标准曲线Fig.6: Determination of selen

40、ium standard curve表2：测定硒的标准曲线Table 2.Determination of selenium standard curve硒含量(g)0612182430吸收值00.1370.2740.4220.5290.688注：此次使用石英比色皿测定，每组设置3个重复，取平均值，获得标准曲线。该曲线仅用于金针菇201菌种及其诱变菌种在液体发酵中所获得的菌丝体富硒能力的测量。图2：测定硒的标准曲线Fig.2:Determination of selenium standard curve3.2.1金针菇在液体富硒培养基中的生长特性表3 白色金针菇及其诱变菌株在液体富硒培养基中

41、的生长特性Table 3.The growth characteristics of the white Flammnlina velutipes and its mutant strains in Se- accumulating liquid training medium菌种培养液灭菌发酵出瓶菌丝球过滤后生物量类型硒浓度前终点总体积直径余液干重(g/L)pH值pH值(mL)(mm)(mL)(g/100mL)白色金针菇原种CK6.772.55931.009.04880.1356.763.52890.7015.00800.17106.823.78881.1213.50840.15156.79

42、4.1891.3012.00810.23206.814.17921.1018.32810.24256.824.02930.5025.70840.24306.843.1921.589.64820.23406.833.62921.308.00850.13白色金针菇诱变5minCK6.783.76931.009.00830.2156.772.75901.0013.00710.48106.813.61911.109.00850.16156.8206.813.95920.889.40870.15256.832.77921.3012.00780.32306.854.46901.0010.09800.214

43、06.832.84871.3211.20710.4白色金针菇诱变10minCK6.783.52931.009.00850.2156.763.19881.5810.00830.11106.834.24921.1016.60860.16156.83.95892.3610.30680.49206.813.71900.889.40850.15256.833.94901.3010.50800.22306.853.89921.0010.09840.21406.833.62911.109.32810.22注:1)摇瓶体积250mL,裝液量为100mL;2)转速为250r/min,温度为25；3）在测定灭菌前

44、pH值时，缓冲液的实时温度是21.5，缓冲液的pH值按照20的标准来校正pH计。在测定发酵终点pH值时，缓冲液的实时温度是24，缓冲液的pH值按照25的标准来校正pH计。本次实验观察了白色金针菇、金针菇201及其诱变菌株在液体富硒培养液中的生长特性，由表34可知：发酵液基本清澈透明，透出淡淡的香味，表明这些培养基未被污染。菌丝球基本呈现球状，例如星球状、微球状、椭球状、圆柱状等。菌丝球基本呈现白色，随着硒浓度的提高，灭菌前pH值逐渐升高。发酵终点pH与菌丝体干重有着较为明显的相关性。在本实验中，我观察到，菌丝球小的培养液中菌丝球的数目多，生物量也大，干燥时间也比较快。表4 金针菇201原种及其诱变菌株在液体富硒培养基中的生长特性Table 3. The growth characteristics of the Flammnlina velutipes 201 and its mutant strains in Se- accumulating liquid training medium菌种培养液灭菌发酵出瓶菌丝球过滤后生物量类型硒浓度(g/L)前pH值终点pH值总体积(mL)直径(mm)余液(mL)干重(g/100mL)金针菇201原种CK6.965.66872.6