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2、一、实验目的：1圆二色性；2圆二色谱的原理及应用；3圆二色谱的相关拓展知识；4圆二色谱的实验技术及操作；二、实验原理：圆二色性是手性分子在光学上表现的一种特性。光可视为振动方向与传播方向 垂直的电磁横波。当光波的电矢量方向以一个固定的角速度以传播方向为轴心匀速 旋转时，称之为圆偏振光。根据圆偏振光电矢量旋转方向的不同，可以将其区分为 左圆偏振光和右圆偏振光.一束平面偏振光可以看成是由两个振幅和速度相同而螺 旋前进方向相反的圆偏振光叠加而成（图1）。两圆偏振光彼此对映，互为镜像。当 手性物质在偏振光的波长范围内存在吸收的时候，其对左右圆偏振光的吸收程度， 也就是摩尔吸光系数，是不同的.此时不但偏
3、振光的偏振平面将被旋转，构成该偏振 光的左右圆偏振光的振幅也将不再相等。组成出射光的左右圆偏振光的电矢量和将 沿一个椭圆轨迹移动，此时的出射光就是椭圆偏振光（图2）.这种光学现象就称为 手性物质所具有的圆二色性.对于纯手性物质，其椭圆偏振光的椭圆度0在特定溶 剂、浓度、温度和光程下，在特定波长处为定值.同时，在特定波长处的椭圆度0 与在该波长处对左右圆偏振光的摩尔吸光系数之差（）成正比。将0或 对波长作图，即得到圆二色光谱。图1右圆偏振光（a）、左圆偏振光（b）及平面偏振光示意图，水平箭头表示光的传播方向。图2 （a）平面偏振光的圆组分；（b）平面偏振光的旋转与圆组分；（c）椭圆偏振光的旋转与
4、圆组分被吸收的情况。其中，OB与OC分别表示右、左圆偏振光被吸收后的振幅,OD表示OB 与OC的矢量和，0表示椭圆偏振光的椭圆率角，tan0=OE/OAQ 8。圆二色光谱的英文名称为Circular Dichroism，简称CD光谱。其光谱仪的基本测试原理是-一通过入射圆偏振光的波长变化，测定手性样品的左圆偏振光和右 圆偏振光摩尔消光系数之差Ae。由于CD光谱反映了光和分子间的能量交换，因 而只能在有最大能量交换的共振波长范围内测。CD光谱可用于分析一般电子光谱所 不能体现出来的能级跃迁的细节，是讨论手性化合物电子跃迁性质的重要表征手段. 当测试条件严格一致时，一对对映异构体的CD光谱呈镜像对
5、称。通常采用光学纯 的样品（即仅含单一对映体）进行CD光谱的测定，可由实验值0根据浓度c、光 程长l求出该纯样的Ae。在严格相同的测试条件下，测定未知样品的CD光谱， 可根据实验值求出未知样的 。根据上述数据可估算未知样品的对映体过量 值(Enantiomeric Excess,简称ee%)。当样品溶解性差、溶剂背景干扰、溶解过程 中绝对构型发生变化时，固相CD光谱测试很有必要。通常对纯样进行CD光谱的测 试，可在样品绝对构型与CD信号间建立关联。对同物质未知ee%值的样品，可通 过CD光谱，简单判断其哪种对映体过量。此外，光谱还可结合其他结构表征手段 用于关联确定手性化合物的绝对构型，或检测
6、靶向分子与DNA等生物大分子的相互 作用。叩如浙 phging图3圆二色光谱仪示意图如图3所示，圆二色光谱仪由氙灯光源、单色系统、偏振系统、样品台、光 电倍增管等部件组成.具体参数如下：光源 两种标配灯：150瓦氙灯及150瓦汞氙灯可同时装置。分离式光源置，205nm 以上测量不需使用氮气，波长205nm以下氮器使用量3升/每分钟.单色器光栅:双光栅1200条/mm。波长设定范围：185至800 nm。光学系统 全反射消色差的光学系统，氟化镁(MgF2 )偏振光学组件，具参比二极 管检测器。数据采集及数据分析采样速率：10微秒/每点-1000秒/每点。波长扫描速度： 最高1200nm/min
7、(0。05秒to 20秒/每点).圆二色测量噪声：0.01 mdeg (2nm, 1sec)。圆二色谱张诗群.基线稳定性：0.01 mdeg/小时。CD分辨率： 最低达0.0006mdeg。CD测量范围： 最高达6500mdeg。三、仪器和药品：（1）、药品:KCl （光谱纯）、纯手性试剂、无水乙醇（A。R。）。（2）、仪器:MOS-450圆二色光谱仪，分析天平,压片机（包括压模等），玛瑙研钵。四、实验步骤：1电源依次打开ALX250光源开关（先开光源盒背后开关，再开光源盒面板开关）， MM450电源开关，计算机电源，预热半小时.查看ALX250面板显示功率，微调 旋钮，将功率确定在150W。
8、2制备样品液相样品：选取洁净的比色皿，为减小实验误差，空白与试样宜采用同一比色 皿。固相压片样品:采用KCl压片法.以光谱纯KCl（需自备）为惰性介质。压制纯 KCl片为空白样，待测样品与KCl混合物压片为试样片,二者质量宜相同，以确保厚 度一致。压片越薄越透明越好。3开启程序（1）点击电脑桌面上的“BioKine图标，进入BioKine软件操作主界面。（2）点击操作主界面的Device/Scanning Spectrometer，进入光谱扫描界面。4安放空白样液相样品：将装有待测样品空白溶液（如水或缓冲盐）的石英比色皿放入样品 仓，确保每次测试比色皿放置朝向相同，盖上盖子.固相压片样品：取下
9、光电倍增管，将带有纯KCl压片的模具置于样品台上，凹 口向内垂直放置，将光电倍增管罩住固体压片模具，锁紧螺丝。5空白样扫描与扣除（1）根据样品的最大吸收波长，输入到操作界面下方的“Ex”处，回车.(2) 点击按钮变为，然后点击，自动调整HV电压，然后再点击按钮，锁定此电 压值。(3) 点击主界面上方的按钮，进行测试参数的设置：a) Acquisition mode：选择测量模式 CD；b) Begin(nm):扫描初始波长；c) End(nm):扫描结束波长；d) Scan Repeat :扫描次数；e) Acquisition duration:每个nm的测量持续时间，范围0.05s20s。
10、此数值越长，则扫描时间越长，信噪比越优；f) Shutter Automatic mode :选择 Always open；g) PM gain*10:当在非常低的信号测量，可选择此项，进行信号的增益。h) CD parameters: CD的灵敏度,根据信号的振幅设置，有四个不同的选项， 1000、 300、 100 和 30 mdeg.上述选项，b)，c)项应根据试样的紫外可见吸收谱带选定，其他参数可选用 默认值。以上参数都设置好后，点击OK按钮，参数设置完成，回到主界面。(4) 点击主界面左方Blank spectrum区域的Record按钮,进行空白样的扫描。(5) 扫描完成后，在第四
11、步的操作区域内，选中Subtract复选框，将在随后进 行的试样光谱测试中扣除空白值.6样品的测量1再点击Shutter按钮关闭挡板，点击HV on按钮变为HV off。将空白样品替 换成待测样品，放置方法与空白样相同。2这时再点击Shutter打开挡板，点击HV off按钮变为HV on，然后点击Auto，自动调整HV电压，然后再点击Auto按钮，锁定此电压值。3点击主界面Acquisition control区域的按钮，进行待测样品的圆二色光 谱扫描。7谱图数据的保持选择主界面的File菜单下的Save As.注意选中左下角的“Save As Text 复选框，则保存的bka文件可由记事本
12、打开.8仪器的关闭光谱扫描完毕，务必先取出样品.关闭操作软件主界面，关闭MM450电源开 关,ALX-250光源开关（光源盒背后开关）；关闭计算机，最后关闭外部电源。五、注意事项1. 每次更换测试样，请确认如下两点：a）光电倍增管处于关闭状态：软件主界面下方的电压提示处于“”状态；b）挡板处于关闭状态:软件主界面下方显示处于灰色的“”状态；2。对于固相样品测试，需移动光电倍增管的情况，光电倍增管需轻拿轻放， 请避免剧烈振动。3。光谱扫描时，请避免实验台面的剧烈震动。4. 实验结束后，固相样品的压片模具严禁在潮湿状态下装入模具盒.为避免 模具生锈，应在清洗后红外灯下烘干。确认干燥后装入模具盒，置
13、于干燥器中。5. 实验数据请存放于“I:Data”目录下。为便于管理，建议以导师姓名为 文件夹名称。6. 每次实验需拷贝的数据，请将另存一份在电脑桌面，并将文件（或文件夹） 名称填写于电脑桌面“需传递数据.xls文档中。请注明数据归属者姓名，电子邮 箱及联系方式。数据拷贝将由管理人员每周传递12次.7。请做好实验登记工作，如实登记所测样品名称,仪器运行情况，以及实验 时间。8。如需进行上述实验内容以外的测试，敬请联系管理人员。六、数据处理：wove lennliJnni图1.空白样圆二色谱图当波长为因为波长在200nm至300nm时，电压大于600V，数据不准确，所以， 200nm至300nm
14、时，数据舍去不用。图4.舍弃数据后样品圆二色谱图由上图我们可以看出谱图出现负峰，CD信号表明是右旋，负的CD信号表明左旋。 在650nm至800nm处有负Cotton效应，由此可以判定该化合物有CD信号，初步断 定为手性化合物，且为左旋。在300780nm范围的峰主要是由于化合物的生色团 引起的，对CD的贡献来自含有金属离子的生色团，这一波段的CD谱对金属离子 的氧化态、配位态及链一链相互作用均是敏感的.查阅资料可知，由于样品中存在负的CD信号，所以样品中含有M (左手螺旋) 构型的Cu (succ)(4, 4-bpy)4H20，他们所属的空间群分别为P6122与 P6 22。5七、思考讨论：
15、1。哪些物质需要收集CD光谱?CD光谱可以提供哪些信息？CD光谱的测量条件：在给定波长范围内有较强的CD信号和合适吸收值的手性 物质.CD光谱提供信息：圆二色谱在有机化合物结构鉴定中有着广泛的应用。可见及 近紫外作为入射光源，这就要求被研究的手性分子要具有发色基团，通过对发色基 团的研究来获得分子结构信息，因此它只能提供分子局部的结构信息。主要用于测 定蛋白质的立体结构 圆二色性R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象。圆二色 谱是一种测定分子不对称结构的光谱法。在分子生物学领域中主要用于测定蛋白质 的立体结构，也可用来测定核酸和多糖的立体结构。2. 在CD光谱测试之前，需要哪些准备工作？(1)
16、圆二色谱反映光和分子间能量转换情况，这种相互作用只在短波范围内共振波圆二色谱张诗群.长周围发生，并且在共振波长处产生最大能量交换，因此圆二色谱仅在这个区域可 以被测量。理想情况下，紫外吸收谱图（UV）中吸收带入max和CD的| AElmax （在图中呈峰或谷）是重合的，但实际上两者是接近的.CD测试前进行UV测试，可 找出其理想的测试光谱范围。（2）理想的溶液中除样品分子具有吸收外，其他物质都不具有光学活性.但研究表 明绝大部分物质在紫外区（尤其是250nm以下深紫外区）都有吸收，并且波长越短， 吸收越强，测试光的强度越低。测试光强度太低时，则无法测试.因此，每种溶剂都 有其测试截止波长。CD
17、测试中应尽可能选用截止波长较短的溶剂，如水、环己烷、 甲醇、乙醇、乙腊、二氧杂环已烷，避免截止波长较长的溶剂，如苯、甲苯等。此 外,CD测试波长扫描时，应尽量避免深紫外区的扫描，减少溶剂以及其他物质的吸收 干扰。（3）根据比耳定律，选用光程较短的吸收池和浓度较大的溶液可以有效地减少溶 剂吸收。虽然比耳公式表明CD信号与其浓度成线性关系，但并不是浓度越高,CD信 号越好。浓度过高将导致吸收峰红移和扁平效应。此外，Ae值非常小，浓度过高 可测光的强度减小，此时吸收所产 生的微小变化则被测试噪音所覆盖，并且光强越 小噪音越大。在波长确定的情况下，理想的浓度所对应的吸光度应在0. 8左右。 因此，CD
18、测试前的UV测试，在找出其理想的测试光谱范围的同时，还可以确定其理 想的浓度.（4 ）有些样品需在一定的盐或缓冲液中才能稳定或接近其实际使用环境。但盐或 缓冲溶液的使用通常又会带来吸收干扰，并且波长越短干扰越强.因此，盐和缓冲 液也有其对应的CD测试截止波长。CD测试中应根据样品性质和所选波谱范围，选用 合适的盐或缓冲溶液，避免吸收干扰。CD信号的质量受倍增电压值影响，理想的倍增电压（DV）为200V左右。当倍增 电压高于500V时，CD噪音增加，测试信号减弱，所测结果不可靠.此时应适当稀释 溶液或选用光程较短的样品池（6）CD样品应尽可能为均相溶液且不含吸光干扰的杂质，如有不溶物则应过滤或离
19、 心去除。为避免纸屑影响，比色皿的擦拭须使用擦镜纸。此外，温度或溶剂的变化常会引起溶液中气体溶解度的变化，析出气体滞留在溶液中就会产生气泡。进行温 度或者滴定实验时，样品放入圆二光谱仪前，应先排除气泡干扰，必要时进行搅拌。 通常样品（包括一些在可见光范围内没有光化学活性的样品）都存在着光化反应， 从而导致CD信号随时间而变.光化反应的变化有时会被波长、温度或其他变化所掩 盖，但通常都遵循以下规律：狭缝减半,光强减为原来1/4时，光化反应的速率也减为原来的1/4.该规律常用在相同光照和缓冲条 件下，区分光化反应和其他动力学反应。CD基线校正的条件应尽可能与样品条件相 同，如相同的测试方法、吸收池
20、、光路方向、缓冲体系，并尽可能缩短测试时间差， 然后通过CD软件中的Math操作去除基线干扰。3。简述CD光谱对你今后科研工作发挥的作用。圆二色谱在有机化合物结构鉴定中有着广泛的应用。可见及近紫外作为入射光 源，这就要求被研究的手性分子要具有发色基团，通过对发色基团的研究来获得分 子结构信息，因此它只能提供分子局部的结构信息。但今后我工作的主要方向是进行直接乙醇燃料电池阳极催化剂的制备以及性能 的研究，制备的一系列催化剂主要是无机化合物，不存在发色基团，主要还是需要 通过BET，SEM，TEM，XRD的测试手段对样品进行表征，通过组装成三电极体系使用 循环伏安法对样品的催化性能进行测试。所以在今后的科研工作中会比较少使用到 CD光谱.八、参考文献1 Nina Berova， Prasad L。Polavarapu， Koji Nakanishi， Robert W.Woody， COMPREHENSIVE CHIROPTICAL SPECTROSCOPY， Wiley， 2012。2 Electronic Circularly Dichroism Spectroscopy， Ferenc Zsila M。D。, Ph。 D。 , 2010.3 章慧，配位化学-原理与应用，化工出版社,2009。
